抗體標記主要有酶標記、熒光素標記、同位素標記、生物素標記等，還有一些其他的標記方法例如金標記，本文主要講述了這些抗體標記的基本原理、操作步驟。

一、酶標記

1、辣根過氧化物酶(HRP)標記

　　辣根過氧化物酶(HRP)標記單抗和多克隆抗體的常用方法是過碘酸鈉法。其原理是HRP的糖基用過碘酸鈉氧化成醛基，加入抗體IgG后該醛基與IgG氨基結合，形成Schiff氏堿。為了防止HRP中糖的醛基與其自身蛋白氨基發生偶合，在用過碘酸鈉氧化前先用二硝基氟苯阻斷氨基。氧化反應末了，用硼氫化鈉穩定Schiff氏堿。

　　方法：

　　(1)將5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混勻，蓋緊瓶塞，室溫避光作用2小時。

　　(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混勻。

　　(3)加入0.75ml小鼠已處理的腹水，或純化單抗等(15mg/ml)，混勻。

　　(4)稱取Sephadex G25干粉0.3g，加入一支下口墊玻璃棉的5ml注射器外筒內;隨后將上述交聯物移入注射器外套;蓋緊，室溫作用(避光)3小時或4℃過夜。

　　(5)用少許PBS將交聯物全部洗出，收集洗出液，加1/20V體積新鮮配制的5mg/ml NaBH4溶液，混勻，室溫作用30分鐘;再加入3/20V NaBH4溶液，混勻，室溫作用1小時(或4℃過夜)。

　　(6)將交聯物過Sephadex g200或Sepharose 6B(2.6×50cm)層析純化，分管收集峰。

　　(7)酶結合物質量鑒定：

　　克分子比值測定

　　酶量(mg/ml)=OD403×0.4

　　IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62

　　克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量，一般在1-2之間。酶結合率=酶量×體積/抗體，標記率一般為0.3-0.6，即1-2個HRP分子結合在一個抗體分子上，標記率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280等于0.4時，E/P約為1。

　　標記率=OD403/OD280

　　酶活性和抗體活性的測定可應用ELISA法、免疫擴散、DAB-H2O2顯色反應測定酶結合物的酶活性，抗體活性及效價、特異性。

　　(8)HRP抗體結合物的保存：加入等量甘油后，小量分裝-20℃存放，防止反復凍融;或加入等量60%甘油4℃保存;不宜加NaN3或酚防腐，否則會影響酶活性。必要時凍干保存，以BSA或脫脂牛奶作保護劑。

2、堿性磷酸酶(AP)標記

　　堿性磷酸酶(AP)用于標記抗體，常用戊二醛一步法，將酶和單抗混合，再加入適量戊二醛，使酶和抗體蛋白的NH2分別與兩個醛基結合，制備成結合物。該法簡便，但所得產物不均一，抗體活性損失大，酶標記率低。其方法如下：

　　(1)將5mg AP加入1ml抗體溶液(2mg/ml)中溶解，裝入透析袋，于4℃對0.01mol/L PH7.2 PBS透析18小時，換液三次。

　　(2)加入2.5%戊二醛20ul，室溫作用1-2小時，4℃對PBS透析過夜，其間換液三次。

　　(3)換用0.05mol/L PH8.0 Tris-HCl緩沖液透析，4℃過夜，換液三次。

　　(4)取出標記抗體，用含1%BSA的Tris-HCl緩沖液稀釋至4ml，即為AP標記物原液。

　　(5)每毫升中加入0.4ml甘油，小量分裝，保存備用。

二、熒光素標記

　　1、異硫氰酸熒光素(FITC)標記

　　FITC標記抗體的原理是在堿性條件下，FITC 的異硫氰基能與IgG的自由氨基結合，形成IgG與熒光素的結合物。FITC常用的熒光素，其次選用TRITC(四甲基異硫氰酸羅丹明)。FITC和TRITC是常用的雙標記組合。其標記步驟如下：

　　(1)以碳酸鹽緩沖液(PH9.3，Na2CO3 8.6g，NaHCO3 17.3g，蒸餾水1000ml)調整抗體濃度至10mg/ml。

　　(2)取5ml抗體溶液置于10ml小燒杯中。

　　(3)稱取1mg FITC溶于0.2ml DMSO中，待溶解后立即緩慢滴加于抗體液內，邊加邊輕攪;其后室溫避光作用2小時。

　　(4)將交聯物經Sephadex G25或G50柱層析除去游離的熒光素;分管收集一峰為標記的抗體。

　　(5)FITC的結合物質量鑒定

　　IgG量(mg/ml)=(OD280-OD495×0.35)/1.4

　　F/P=2.87×OD495/(OD280-OD495×0.35)，一般說，FITC對抗體的摩爾比為3：1時適合于組織切片染色，為5-6：1時適合于細胞懸液染色。以標記抗體染色各種抗原，測定其特異性染色滴度和非特異染色的程度。

　　(6)標記抗體的保存：宜保存于4℃，加NaN3防腐。

　　2、異硫氰酸羅丹明(TRITC)標記： 基本與FITC標記相同。

三、同位素標記

　　必須強調的是在使用同位素標記單抗或其他蛋白之前，應掌握同位素操作和防護知識。正常情況下應包括避免物理的接觸和對γ-射線照射的**保護，操作和使用同位素標記抗體時，應利用防護裝置，并合理處置含放射性的廢料。

　　1、碘標記

　　用碘標記抗體是一種標記方法。125I衰變產生低能的γ和χ射線，很容易被檢測出來，而其60天的半衰期保證足夠的**使用期，且能很方便地處理放射廢料。常用的碘標記方法是氯胺T法，即將氧化劑氯胺T加入到抗體和碘化物的溶液中，Na125I在氯胺T作用下I轉化成I2，游離I2可與抗體分子中酪氨酸和一些組氨酸發生鹵化反應，用還原劑和游離酪氨酸終止反應，經凝膠過濾將標記的抗體與碘化酪氨酸及還原劑分離開。其主要操作步驟如下：

　　(1)在進行標記之前，先選用截流分子量為20000-50000的凝膠，制備1ml凝膠柱，然后分別用10倍體積的1%BSA/PBS/0.02%疊氮鈉和PBS洗滌柱體，封住柱下口，備用。

　　(2)加入10ug純化單抗至含有25ul 2.5mol/L磷酸鈉(PH7.5)的1.5ml指形管內。隨后，加入500uCi Na125I混勻。

　　(3)加入25ul新配制的2mg/ml氯胺T。室溫放置60秒。再加入50ul氯胺T終止液(含2.4mg/ml偏重亞硫酸鈉，10mg/ml酪氨酸，10%甘油和0.1%環乙烷酰二甲苯的PBS)。

　　(4)將上述碘標記物上樣在凝膠柱表面，小心放開柱體下口，用1.5ml指形管收集。當碘標記物全部進入柱體，加入0.3ml含0.03%疊氮鈉的PBS，用另一指形管收集0.3ml，然后再加0.3ml 0.03% NaN3 PBS，下口收集0.3ml，重復進行，同時用同位素檢測儀測定標記與未標記的單抗。標記抗體大約在**至第四管出現。無害化處理柱子和非單抗標記部分。

　　(5)將標記單抗保存于4℃可使用6周時間。

　　2、生物合成法標記

　　將雜交瘤細胞培養在含有放射性前體的培養基中，隨著抗體分子的合成、組裝，同位素會標記在抗體分子的初級氨基酸鏈上，本方法不會導致抗體活性的喪失。其主要步驟是：

　　(1)離心收集處于對數生長期的雜交瘤細胞，約需2×106個細胞。以預熱37℃不含甲硫氨酸的培養基洗滌上述細胞。

　　(2)用含2% PBS不含甲硫氨酸的培養基懸浮雜交瘤細胞至106個/ml，加入35S甲硫氨酸(每次加入100uCi可產生105-106cpm的抗體)。

　　(3)經C02培養箱中培養過夜，離心后，吸出培養上清，分別加入1/20體積的1mol/L Tris(PH8.0)及疊氮鈉至濃度0.02%。該標記抗體可按純化單抗方法進行。

四、生物素標記

　　生物素標記反應常用生物素琥珀酰亞胺酯進行。生物素是與抗體分子的游離賴氨酸等發生偶聯反應而完成標記。其主要步驟是：

　　1、用二甲基亞砜配制10mg/ml的N-羥琥珀酰亞胺生物素(應根據需要選用不同大小和間臂長的生物素化琥珀酰酯)。

　　2、用硼酸鈉緩沖液(0.1mol/L，PH8.0)稀釋單抗溶液至1-3mg/ml。

　　3、每毫克抗體加入25-250ug的生物素酯，混勻后，室溫作用4小時。

　　4、按每250ug生物素酯加入20ul 1mol/L NH4Cl終止反應，室溫放置10分鐘。

　　5、以PBS充分透析除去游離生物素，標記抗體凍存。

五、其他標記方法

　　適用于蛋白質的其他標記方法也可用于單抗，如金標記、化學發光標記、SPA標記、鐵蛋白標記等。

　　免疫標記是一種操作簡單、靈敏度高的，主要原理是級聯方法效應。單抗已經廣泛用于疾病診斷等，主要是利用單抗標記的診斷試劑盒進行的。

西安齊岳生物供應單克隆抗體標記HRP辣根過氧化物酶，生物素，FITC等產品