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單克隆抗體OX26修飾丹酚酸B/黃芩苷納米脂質(zhì)載體實(shí)驗(yàn)研究

發(fā)布時(shí)間：2021-05-25 作者：axc 分享到：

〖要點(diǎn)一〗OX26-Sal B/BA-NLC的制備與評(píng)價(jià)

（1）SalB/BA-NLC的制備：采用乳化-固化法制備OX26-Sal B/BA-NLC。精密稱(chēng)取Sal B提取物3.5 mg，加入2 mL去離子水溶解，并稱(chēng)取Myrj 52 300 mg加入到9 mL去離子水中，水浴74 ℃溶解。在磁力攪拌下，將溶解完全的Sal B水溶液加入到Myrj52中，混合均勻，共同構(gòu)成水相。稱(chēng)取BA提取物1.5 mg并溶于2 mL無(wú)水乙醇中，溶解完全后，加入50 mg卵磷脂，使二者混合均勻；另外稱(chēng)取Compritol 888 ATO 50mg、Miglyol 81220 mg以及適量的mPEG-MAL與mPEG-OH，加1 mL氯仿使之溶解，并將乙醇溶液與氯仿溶液合并，混勻，構(gòu)成油相。保持水相在74 ℃的水浴中磁力攪拌，隨之將混合好的油相滴入到水相中。待體系澄清時(shí)，降低轉(zhuǎn)速，繼續(xù)攪拌至總體積的1/3，冰水浴2 h。

（2）OX26的硫醇化：采用Traut’s試劑對(duì)單克隆抗體進(jìn)行巰基化[19]。將抗體OX26置于0.15 mol/L硼酸鈉/0.1 mmol/L EDTA緩沖液（pH 8.5）中。混合均勻后，加入Traut’s試劑，加入量根據(jù)OX26與2-iminothiolane物質(zhì)的量比為1∶40計(jì)算獲得。磁力攪拌下，沖氮、避光、室溫反應(yīng)1 h。將反應(yīng)后的抗體經(jīng)HitrapTM脫鹽柱洗脫分離，洗脫液為0.01mol/L的HEPES緩沖液（pH 7.0）。

（3）OX26與Sal B/BA-NLC的連接：將上述制得巰基化的OX26與Sal B/BA-NLC混合，按照Maleimide與巰基比為3∶1進(jìn)行混合。混勻后將其放置在避光條件下，充氮，磁力攪拌8 h。反應(yīng)后，以0.01 mol/L的PBS緩沖液（pH 7.4）為洗脫液，過(guò)SepharoseCL-4B柱以除去游離的蛋白OX26，即得抗體修飾后的納米粒混懸液體系OX26-Sal B/BA-NLC。

〖要點(diǎn)二〗OX26-Sal B/BA-NLC中Sal B及BA的含量測(cè)定方法及包封率測(cè)定

（1）色譜條件：色譜柱為Diamond Dikmaods C18柱（200mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-乙腈- 0.2%磷酸水溶液（22.5∶22.5∶55）；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：分別精密稱(chēng)取Sal B對(duì)照品和BA對(duì)照品適量，甲醇溶解并定容，作為儲(chǔ)備液。取適量?jī)?chǔ)備液，加甲醇配制成SalB質(zhì)量濃度為1.06、6.10、10.16、28.45、71.12 μg/mL，BA質(zhì)量濃度為0.72、4.32、7.20、20.16、50.40 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。按照上述色譜條件，進(jìn)樣20 μL，記錄其峰面積，以峰面積（A）對(duì)質(zhì)量濃度（C）做圖。得到Sal B的回歸方程為A＝23 231 C－ 6 393.4，r＝0.999 9；BA的回歸方程為A＝72 709 C－11 437，r＝0.999 9。

（3）精密度考察：選取低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（1.06、10.16、28.45 μg/mL）的混合對(duì)照品溶液1 d內(nèi)重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算日內(nèi)RSD；連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算日間RSD。結(jié)果顯示，Sal B和BA的日內(nèi)、日間RSD均小于2%，精密度符合方法學(xué)要求。

（4）包封率的測(cè)定：實(shí)驗(yàn)選用超濾離心法測(cè)定其包封率。將0.2 mL納米制劑加去離子水稀釋至3.0mL，置于超濾離心管中，5000 r/min離心20 min。離心后取外管中的樣品進(jìn)行HPLC測(cè)定，即為W游。另取0.2 mL納米制劑，加入甲醇2.8 mL超聲，5 000 r/min離心20 min，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液經(jīng)HPLC測(cè)定，即為W總。計(jì)算Sal B及BA的包封率［包封率＝(W總－W游)/W總，其中W游為載藥NLC中游離**質(zhì)量，W總為載藥NLC中總的**質(zhì)量］。

結(jié)果顯示，Sal B/BA-NLC中Sal B與BA的包封率分別為（99.79±0.19）%和（89.60±3.53）%，OX26-SalB/BA-NLC中Sal B與BA包封率分別為（95.77±2.42）%和（54.93±5.00）%。

〖要點(diǎn)三〗形態(tài)觀(guān)察：利用TEM對(duì)Sal B/BA-NLC和OX26-Sal B/BA-NLC進(jìn)行形態(tài)觀(guān)察。分別取適量的Sal B/BA-NLC和OX26-Sal B/BA-NLC置于銅網(wǎng)上，室溫干燥后，用2%的磷鎢酸對(duì)其染色，再次自然干燥。采用TEM觀(guān)察并攝制照片，見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，Sal B/BA-NLC和OX26-Sal B/BA-NLC粒子多呈圓形，分散較好，且大小均勻。