通過(guò)引入蛋白酶激活RNA聚合酶（PR），構(gòu)建了一種基于蛋白水解激活轉(zhuǎn)錄和CRISPR-Cas12a的蛋白酶檢測(cè)新方法。在該方法中，目標(biāo)蛋白酶通過(guò)特異性水解多肽從而解除對(duì)T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄活性的**，實(shí)現(xiàn)蛋白酶信號(hào)到gRNA信號(hào)的放大轉(zhuǎn)換，隨后在dsDNA存在條件下激活Cas12a的附屬切割活性，水解底物探針產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白酶兩步放大檢測(cè)。通過(guò)引入PR，該方法不僅成功的為蛋白酶高靈敏檢測(cè)提供新的思路同時(shí)還將CRISPR-Cas12a成功應(yīng)用于蛋白酶生物標(biāo)志物的檢測(cè)。

PR-Cas用于蛋白酶檢測(cè)的示意圖：以gRNA為橋梁，當(dāng)目標(biāo)蛋白酶存在時(shí)，其能特異性水解T7 RNA聚合酶和溶菌酶之間的底物多肽，恢復(fù)T7 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄活性，從而成功的將蛋白酶信號(hào)轉(zhuǎn)換為多個(gè)可被Cas12a識(shí)別的gRNA。在dsDNA存在的條件下，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的gRNA能夠**激活Cas12a的酶切活性，產(chǎn)生可測(cè)得的熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白酶的**檢測(cè)。

圖1：（a）T7 RNAP介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄與CRISPR-Cas12a偶聯(lián)的示意圖。（b）不同gRNA引導(dǎo)序列長(zhǎng)度對(duì)Cas12a非特異性切割活性的影響：結(jié)果表明當(dāng)用到序列長(zhǎng)度為20 nt時(shí)可以充分激活Cas12a的非特異性切割活性。（b）Cas12a對(duì)低濃度gRNA的響應(yīng)。

圖2：（a）PR-Cas檢測(cè)MMP-2的示意圖。（b）SDS-PAGE表征PRMMP-2的酶切。（c）MALDI-TOF MS表征MMP-2對(duì)PRMMP-2的酶切。（d）PAGE凝膠電泳表征MMP-2對(duì)LbCas12a非特異性切割活性的調(diào)控。（e）PR-Cas對(duì)MMP-2的熒光響應(yīng)。

圖3：（a）PRMMP-2-Cas對(duì)不同濃度的MMP-2的熒光動(dòng)力學(xué)曲線。（b）PRMMP-2-Cas和Pep對(duì)不同濃度MMP-2響應(yīng)的校準(zhǔn)曲線。

圖4：（a）PR-Cas檢測(cè)凝血酶的示意圖。（b）PR-Cas對(duì)MMP-2的熒光響應(yīng)。（c）PR-Cas對(duì)凝血酶的特異性考察。

圖5：（a）PRMMP-2-Cas檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基上清液和血清樣品中的MMP-2活性原理圖。（b）歸一化熒光強(qiáng)度表征PRMMP-2-Cas對(duì)不同細(xì)胞培養(yǎng)基上清的熒光響應(yīng)。（c）歸一化熒光強(qiáng)度表征PRMMP-2-Cas對(duì)血液樣本中MMP-2的響應(yīng)熒光響應(yīng)。

利用PR的信號(hào)轉(zhuǎn)換能力，可以將靶標(biāo)蛋白酶信號(hào)轉(zhuǎn)換為多個(gè)可以激活CRISPR-Cas12a非特異性切割活性的gRNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白酶的兩步放大檢測(cè)。此外，基于PR-Cas的可編程性，可以通過(guò)改變PR的底物多肽便可實(shí)現(xiàn)蛋白酶的通用化檢測(cè)。PR-Cas的成功構(gòu)建不僅拓展了CRISPR-Cas系統(tǒng)在蛋白酶檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用，還為蛋白酶生物標(biāo)志物的高靈敏檢測(cè)提供了新的策略在生化研究和臨床診斷中具有廣闊的應(yīng)用前景。

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zzj 2021.3.26