中性粒細胞嗜天青顆粒的主要成分，人類中性粒細胞彈性蛋白酶（HNE）參與病原體的破壞和呼吸道的炎癥過程調(diào)節(jié)，還可以切割氣管的細胞外基質(zhì)成分，并促進中性粒細胞向炎癥部位遷移，而炎癥部位與常見的肺部疾病高度相關(guān)。因此，HNE被認為是**發(fā)現(xiàn)的**靶標(biāo)，也是多種肺部疾病的生物標(biāo)志物。鑒于其光化學(xué)和光物理特性以及可調(diào)節(jié)的發(fā)射范圍，基于量子點的熒光策略可以改善傳感性能，此類成像探針已被用于酶測定。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）通常發(fā)生在兩個距離適當(dāng)?shù)臒晒鈭F之間（<10 nm），但是用于監(jiān)測體內(nèi)蛋白酶活性仍然存在FRET的變化并不明顯、熒光傳感特性不足等缺陷。將有機染料與量子點整合到肽底物中可以提供一種可控且可擴展的策略用于構(gòu)建檢測蛋白酶的FRET系統(tǒng)。

通過將磺基羅丹明B和羧基化的量子點組裝到寡肽底物（QPMAVVQSVPQK）中，構(gòu)建了基于FRET系統(tǒng)的納米探針，用于肺部疾病成像。該底物在兩個纈氨酸殘基之間的酰胺鍵可被小鼠和人類的彈性蛋白酶水解，用于檢測體外和體內(nèi)的HNE。通過該納米探針可以將活細胞和肺**小鼠模型中內(nèi)源性HNE進行高度靈敏和特異性的監(jiān)測，并且成功地用于檢測患者血清中的HNE活性。

基于FRET的肽探針通常可用于監(jiān)測體內(nèi)蛋白酶活性以對體內(nèi)的特定靶分子進行成像。一般來說，FRET的肽探針包括三個部分：量子點作為供體，磺基羅丹明B（Rh）作為受體，HNE特異性肽作為連接體。在量子點表面上的羧基活化后，將兩種彈性蛋白酶特異性肽QPMAVVQSVPQK-Rh（P1）和APEEIMAQK-Rh（P2）通過酰胺鍵整合到量子點表面，從而制備量子點-肽復(fù)合物。通過比較P1和P2對量子點的淬滅效率和HNE的裂解效率，作者選擇了P1來構(gòu)建基于量子點的FRET探針。CdSe/ZnS量子點和InP/ZnS量子點分別與P1組裝，InP/ZnS快速被磺基羅丹明B淬滅，而 CdSe/ZnS探針具有更高的FRET效率和HNE催化活性。HNE可以裂解FRET探針中兩個纈氨酸之間酰胺鍵連接處，導(dǎo)致FRET系統(tǒng)破壞，量子點的綠色熒光恢復(fù)和Rh的紅色熒光下降。

為了驗證FRET探針組裝過程，分別進行了動態(tài)光散射、透射電鏡、Zeta電位和紅外光譜測試。通過光致發(fā)光光譜研究了該探針的FRET效率和是否存在交替激發(fā)缺陷，發(fā)現(xiàn)FRET效率高達78.5%，并且該探針可以克服來自動物組織的干擾并用于體內(nèi)成像。該FRET探針特異性和靈敏性分別采用不同的蛋白酶和不同濃度的HNE在復(fù)雜的生物樣品中研究該FRET探針的特異性和靈敏性，發(fā)現(xiàn)該探針具有高度的特異性和低至7.15 pM的檢測限。在生理條件下，通過Michaelis-Menten曲線研究了該探針作為底物的動力學(xué)特征和HNE活性及其**劑的能力。根據(jù)該米氏方程曲線得到的動力學(xué)參數(shù)（Km和Km/kcat）分別為~142.3 nM和~997 mM-1?s-1。該探針的總體催化效率（Km/kcat）與商業(yè)底物幾乎相同，但對該探針的親和力比商業(yè)底物高275倍（Km）。

HNE對FRET探針和商用底物的Michaelis-Menten曲線和****濃度曲線

由于HNE促進肺**的生長，于是將FRET探針應(yīng)用于肺**細胞（A549）中的HNE成像。通過FRET探針在A549細胞中的定位，發(fā)現(xiàn)量子點和染料標(biāo)記的肽特異性地在溶酶體中積累，這可能是A549細胞的吞噬作用和靜電相互作用引起的。接下來，將FRET探針直接注入小鼠肺**模型以研究其體內(nèi)成像能力。在原發(fā)性**位置，綠色熒光逐漸增加，而紅色熒光隨時間延長而減弱。FRET探針的體內(nèi)研究還揭示了肺部**進展與HNE水平升高之間的強烈關(guān)聯(lián)。為了探究綠色熒光增強是否由于活細胞中HNE的動態(tài)變化引起的，通過蛋白質(zhì)印跡分析證實了脂多糖刺激確實增加了細胞中的HNE濃度。FRET探針可以監(jiān)測炎癥誘導(dǎo)的活細胞中HNE的增加，通過脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷研究該探針在炎癥環(huán)境中的表現(xiàn)。通過直接檢測3名健康人和13名患有不同肺部疾病（肺**、肺結(jié)核和肺真菌病）的人血清樣品中的HNE發(fā)現(xiàn)，患有不同肺部疾病的患者的HNE水平均顯著高于健康人。通過基于FRET探針的方法檢測到的HNE水平與臨床診斷高度相關(guān)，該方法適用于定量測定臨床樣品中的HNE。

HNE對FRET探針和商用底物的Michaelis-Menten曲線和****濃度曲線

通過將磺基羅丹明B和羧基官能化的量子點組裝到寡肽底物（QPMAVVQSVPQK）中，構(gòu)建了基于FRET系統(tǒng)的納米探針用于肺部疾病成像。該研究為基于量子點的FRET系統(tǒng)分析酶活性提供了有價值的策略，明顯提高了催化效率、靈敏度和光穩(wěn)定性。由于HNE是重要的**靶標(biāo)，該探針還可用于高通量篩選HNE**劑以發(fā)現(xiàn)**。該策略證明了基于FRET系統(tǒng)的納米探針在成像性能方面的優(yōu)勢，并為體內(nèi)HNE檢測和肺部疾病診斷提供了新的工具。

西安齊岳生物供應(yīng)抗體種屬∶兔抗單克隆抗體，鼠抗單殼隆抗體。兔抗多殼隆抗體。抗體的濃度為1mglml。抗體及相關(guān)標(biāo)記抗體:HRP標(biāo)記抗體，Biotin標(biāo)記抗體，Gold標(biāo)記抗體，RBITC標(biāo)記抗體，AP標(biāo)記抗體,FITC標(biāo)記抗體，Cy3標(biāo)記抗體，Cy5標(biāo)記抗體，Cy5.5標(biāo)記抗體，Cy7標(biāo)記抗體，PE標(biāo)記抗體，PE-Cy3標(biāo)記抗體，PE-Cy5標(biāo)記抗體，PE-Cy5.5標(biāo)記抗體，PE-Cy7標(biāo)記抗體，APC標(biāo)記抗體，AlexaFluor 350標(biāo)記抗體，Alexa Fluor 488標(biāo)記抗體，Alexa Fluor 555標(biāo)記抗體，AlexaFluor647標(biāo)記抗體抗體的交叉反應(yīng)︰人，小鼠，大鼠，雞，狗，豬，羊，牛，兔.....抗體的應(yīng)用:可以用于做石蠟切片免疫組化，冰凍切片兔疫組化，Elisa , wB，免疫熒光等實驗。

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zzj 2021.3.26