丙型肝炎病毒(HCV)是世界范圍內慢性病毒性肝炎的主要病原之一,約有1.7億人被感染,常導致嚴重肝病,包括肝硬化和肝細胞**(HCC) 1HCV的基因組含有一個長的開放閱讀框架( ORF),編碼一個約3 010個氨基酸殘基( aa)組成的多蛋門,該多蛋白被細胞和病毒蛋白酶切割產生至少10個病毒基因產物:核心蛋自( core:).E1 、E2 、 p7, NS2 , NS3 , NS4A,NS4B , NS5A和 NS5B蛋白等2。F蛋門是 HCV基因組[ RNA 的核心蛋白編碼序列表達了1個17 kD的蛋白。關于其功能研究較少。我們利用**性消減雜交( suppression sub-tractive hybridization , SSH)技術,對于表達HCV F載體轉染的HepG2細胞進行研究,闡明了F蛋白反式激活的部分靶基因,同時我們結合生物信息學( bioinformat-ics)技術克隆了F蛋白反式激活的新型靶基因,即丙型肝炎病毒F蛋白反式激活蛋白2(HCV FTP2)基因。為了進一步研究此蛋白與人體細胞的相互作用,我們在酵母細胞中表達了HCV FTP2基因。

材料與方法

一.材料

HepG2細胞及感受態大腸桿菌DH5 α,c-myc單克隆抗體,ATCC的1-9E10.2雜交瘤產生。辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgC。酵母細胞AH109、載體. pC-BKT7及酵母YPD培養基、SD/ - Trp、- Leu等培養基。Taq DNA聚合酶。T4 DNA 連接E,EcoRI和 BamHI 。內烯既胺.N，N'-亞華雙山烯酰胺.異丙基硫代-j-D-半乳糖(1PTG)及X-3-Gal及pGEM-T載體。TEVED 。醋酸肛.半硫酸腺苷。

二.HCV FTP2基因的擴增

根據電子拼接的基樹序列,在編碼區的土游和下游分別設計合成一對寡聚核苷酸引物(PI5'-GAA TTCATG GCA GGT CCA GAA AGT-3`和P2 5 '-GGA TCC TTATGT TGC TTT CACAGC-3 '.在引物的兩端引人了 EcoRI及BamHI隨切位點,引物由上海生工公司合成。在0.5 mL的Eppendorf 管中依次加入17.3 pL雙蒸水.2.5;山L的10×緩沖液(含 20 mmol·L.' MgCl, ) .2 pl 2.5mmol-1.'dVTP. 1 ,.l 10 ;.mmol ·I. ' P1 , l ,l 10 pimmol ·L-' P2. 1 ,ul cDNA模板.0.2;l Taxq DNA聚合酶(5× 105U·L-'),放入PE9600 PCR役中擴增。擴增條件:94℃變性35 s,58℃退火35 s.72℃延伸 45 s,循環35次后,72℃保溫10 min。20 g·l.'瓊指糖凝膠電泳鑒定擴增結果,

三.pGBKT7-HCV FTP2的構建與鑒定

將經玻璃奶回收、粉/瓢仿抽提.乙醇沉淀的上述PCR反應產物與pGEM-T載體按3:l mol./L.混合,在16℃用 TDNA連接商連接過夜,隨后轉化入用氯化鈣法制備的大腸桿菌DH5α感受態細抱.在鋪有IPTG;及5-澳-4氯-3嗚噪-3-D-半乳糖干(X-3-Gal)的氨芐西林瓊脂糖平板上進行藍白菌落篩選,挑取自色菌落用堿裂解法提取質粒DNA進行梅切鑒定及測序,證明 HCVFTP2基因已被克隆進T載體。該質粒及pGBKT7;均用 EcoRI及BamH兩切,在T載體上釋放的HCV FTP2基因用上述相同的方法連接到pGBKT7載體中,轉化后接種于卡那霉素平板上,隨機挑收平板上生長的菌落,堿裂解法抽提質粒DNA,雙醇切及PCR 鑒定。

四、HCV FTP2在酵母細胞中表達

轉化酵母細覽AH09并長達州醋酸法轉化,轉化后鋪板于SD/-Trp進行篩選。挑取2 mm 、3 mm大小的菌落過夜培養后、提取存母蛋自質。表達產物的十二烷基奭酸鈉聚丙烯-酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和!Westernblot免疫印跡分析均按常規方法進行。由于在酵母表達載體pGBKT7的多克隆位點前帶有人c-myc的標簽,我們所表達的融合蛋白亦帶此標簽,因此用抗人c-mye單克隆抗體與之進行免疫反應。

實驗結果

一、載體構建

HCV FTP2基因的擴增和lpGBKT7-HCV FTP2重組質粒的構建(圖1)。

圖IpGBK17-HCV FTP2質粒圖

二、pGBKT7-HCV FTP2質粒酶切鑒定

利用自行設計的引物Pl/P2成功擴增出 HCVFTP2基閃片段,PCR產物經20 g.1~'瓊脂糖凝膠電泳分析顯示擴增片段約177 bp,預期片段符合,且無非特異擴增現象。用PCR擴增HCV FTP2基因測序結果顯示序列王確。用雙酶切所得片段,連接到用相同的EcoRI及 BamHl 所切的pGBKT7中經酶切鑒定所獲結果正確(圖2)。

圖2pGBKT7-HCV FTP2 EcoRI 及 BamHI 酶切鑒定

由此表明HCV FTP2基因已正確克隆人熊母表達載體 pGBKT7 中 , pGBKT7-HCV FTP2質粒構建成功。

三、pGBKT7-HCV FTP2質粒轉化酵母AH109株

用醋梭鋰法轉化能母后在SD/-Trp培養基上篩選生長。山于AH109株為色氨酸營養缺陷,質粒pG-BKT7中帶有色氨酸基因,轉化成功的AH109可以在缺少色氨酸的培養基上生長。培養數天后,挑取一菌落進行PCR擴增HCV FTP2基因。結果顯示轉化成功(圖3)

四、表達產物的SDS-PAGE和Western免疫印跡分析

提取未轉化質粒與j轉化了質粒的辭母蛋自質,進行SDS-PAGE和lWesternblot統絞印跡分析結果(圖 43結果顯示對照無表達而轉化了pGK77-HCV FTP2的酵f母蛋白提取物Western blut印跡分析可見明顯條帶且無雜帶。

圖3pGBK17-HCV FTP2菌落進行PCR鑒定

圖4HCV FTP2 Western blotting分析1道是HV FTP2蛋白.2道是陽性對照轉化PCBKT7空載體,3未轉化質粒

F蛋白是一個新鑒定的HCV基{國產物 3-5。編碼F蛋白的開放閱讀框與核心蛋門的編碼序列重疊，是翻譯過程中核糖體閱讀框發生-2/＋!位漂移產生的,與核心蛋自具有相同的N-端序列。下蛋白與核心蛋白.NS5A相似,亞細胞定位于內質網5-91,但顯示比核心蛋白有更多的序列差異性,核心蛋自的突變導致患者逃避宿主免疫反應,可能觸發了細胞的惡性轉化。核心蛋門的某些功能是否是F蛋白的作用,F蛋白是否調控HCV RVA的復制,是否參與病海的形態形成及在病毒生命周期中調節細胞功能是否發揮重要作用、尚不清楚。為進一步研究f蛋自的功能,明確F蛋白

在丙型肝炎發病機制中的作用,我們構建酵母雙雜交表達載體并在熊母細胞中表達了HCV FTP2基因。

辭母是一種低等真核生物,與原核細胞相比在翻譯加工方面其有明顯的優點,例如蛋白質中二硫鍵的**形成.糖基化,磷酸化.寡聚體的形成等。另外,他比哺乳動物細胞操作簡便,容易培養,因此酵母細胞作為一種真核基因的表達系統有著良好的前景。我們為了研究HCV FTP2的作用,克隆了HCV FTP2基因,把HCV FTP2基因在酵母表達載體pGBKT7中與c-myc標簽基因片段及DVA結合域(GAlA:.1s7,氨基酸基因)基國在酵母表達載體中融合成功并且表達,在Westernblot免疫印跡分析時用其標簽單克隆抗體檢測到大小符合融合蛋自大小的蛋白質.說明HCV FTP2融合蛋白在酵母中表達成功。表達產物存在于酵母細胞內。隨著基因組計劃的完成,以后的研究進入了后基因組和蛋自質組階段, pGBK17 - HCN FTP2酵母雙雜交融合蛋白“餌”表達系統的建立,為研究HCV FTP2與細胞內蛋自的相互作用奠定了基礎,對深入了解HCVFTP2的結構與功能以及在人體中對宿主細胞的作用提供幫助。

西安齊岳生物供應抗體種屬∶兔抗單克隆抗體，鼠抗單殼隆抗體。兔抗多殼隆抗體。抗體的濃度為1mglml。抗體及相關標記抗體:HRP標記抗體，Biotin標記抗體，Gold標記抗體，RBITC標記抗體，AP標記抗體,FITC標記抗體，Cy3標記抗體，Cy5標記抗體，Cy5.5標記抗體，Cy7標記抗體，PE標記抗體，PE-Cy3標記抗體，PE-Cy5標記抗體，PE-Cy5.5標記抗體，PE-Cy7標記抗體，APC標記抗體，AlexaFluor 350標記抗體，Alexa Fluor 488標記抗體，Alexa Fluor 555標記抗體，AlexaFluor647標記抗體抗體的交叉反應︰人，小鼠，大鼠，雞，狗，豬，羊，牛，兔.....抗體的應用:可以用于做石蠟切片免疫組化，冰凍切片兔疫組化，Elisa , wB，免疫熒光等實驗。

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zzj 2021.3.25