通過長期在小鼠腹膜內注射玉米油或四氯化碳建立肝纖維化動物模型，分別給予TAF 4.5 mg/（kg·天）或TDF 50 mg/（kg·天）處理。其次，體外實驗檢測了TAF/TDF對肝星狀細胞（LX-2細胞）分化、激活、增殖的影響。在TAF/TDF處理后的小鼠肝臟及LX-2細胞中檢測NS5ATP9表達水平以及TGFβ1/Smad3、NF-κB/NLRP3炎性小體信號通路的活性。最后，體內、外實驗中，分別基因敲除或基因沉默NS5ATP9后檢測纖維化相關基因表達水平。

1.TAF/TDF在小鼠體內****四氯化碳誘導的肝纖維化

動物實驗顯示，TAF/TDF****四氯化碳誘導的小鼠肝纖維化及肝臟炎性反應，同時體外研究發現TAF/TDF可以調節肝星狀細胞分化、激活、增殖：TAF/TDF**下調細胞外基質沉積相關基因的表達水平，并改善Ishak評分系統評估的肝纖維化嚴重程度（圖1）。

圖1. 基于Ishak評分系統評估的纖維化評分和分級（n=7）

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.TAF/TDF在體內外均**TGFβ1/ Smad3、NF-κB/ NLRP3炎性小體信號通路的活性

TGFβ1/Smad3信號通路是目前已知的關鍵的肝纖維化驅動因素[3]；NLRP3炎性小體能夠激活NF-κB信號通路，導致肝星狀細胞激活、膠原沉積、凋亡蛋白酶1和白細胞介素1β釋放[4-6]。

四氯化碳誘導的肝纖維化中，TGFβ1/Smad3和NF-κB信號通路被激活，而TAF/TDF**使其活性**降低；TAF/TDF降低四氯化碳誘導的肝纖維化中升高的NLRP3、凋亡蛋白酶1和白細胞介素1β水平（圖2），且TAF/TDF****LPS激活的NLRP3炎性小體和肝星狀細胞；TAF/TDF促使TGFβ1激活的肝星狀細胞轉化為靜息狀態（合成蛋白及mRNA水平降低），并促進肝星狀細胞凋亡、**其增生。

綜上，TAF和TDF通過TGFβ1/Smad3和NF-κB/NLRP3炎癥小體兩條平行信號通路影響肝纖維化的進程；同時，因為NF-κB信號通路在TGFβ1/Smad3激活后會自發激活，所以推測兩條信號通路之間也存在相互調節。

圖2. Western Blot及PT-qPCR分析顯示的小鼠肝臟內NLRP3表達水平   注：*P<0.05

3.TAF/TDF通過NS5ATP9在體內外減輕肝纖維化

丙型肝炎病毒非結構蛋白5A反式激活蛋白9（NS5ATP9）被發現能夠**肝星狀細胞的增生并促進其凋亡[7]。NS5ATP9缺陷**增加細胞外基質沉積并加重肝臟損害；TAF/TDF在體內外均上調NS5ATP9的表達（圖3）。NS5ATP9過表達****TGFβ1/ Smad3和NF-κB信號通路，而沉默NS5ATP9使這些信號通路的活性**增強；因此NS5ATP9通過TGFβ1/ Smad3和NF-κB/ NLRP3炎性小體信號通路**肝纖維化。體內外基因敲除或基因沉默NS5ATP9均降低TAF/TDF**效果。

TAF/TDF通過上調NS5ATP9表達，調控TGFβ1/Smad3和NF-κB/NLRP3炎性小體信號通路，從而阻止肝纖維化的進展并促進其逆轉。TAF/TDF可調控肝星狀細胞分化、激活、增殖。該研究結果提供了TAF/TDF可能具有抗肝纖維化作用的證據。

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zzj 2021.3.24