在酶困定化研究中載體對底物和產物的吸附會造成載體內部和載體周圍底物和產物的濃度不均-，從而使固相酶活力的測定受到影響;同時，吸附現象也會改變酶的Km值，這種吸附在用微球載體固定化酶時尤為突出，本文用胺化聚苯乙烯微球載體固定生物素化堿性磷酸酶時載體的吸附現象及其對酶活力和酶的動力學常數Km值的影響.

實驗部分

1、交聯聚苯乙烯乳膠懶球的制備及功能基化

2、生物素化堿性磷酸酶的制備

3、生物紊化堿性磷酸酶的固定化

4、載酶赦球對產物和底物的吸附

5、酶活力及動力學常數Km值的測定 堿性磷酸酶的活力單位為37 ℃下 1 min 催化水解l umol對硝基苯磷酸所需的酶量.

酶活力在DEA緩沖液(含15 mmol/L 對硝基苯磷酸)中測定，用2 mol/L NaOH的DEA緩沖液終止反應.

固相酶活力測定;以含有滅活的固定化酶微球的不同濃度的對硝基苯酚溶液作標準曲線.Km值依v-'~[S]-‘雙倒數動力學曲線求得.

結果與討論

在含一定濃度的對硝基苯磷酸(pNPP)及不同濃度的對硝基苯酚(pNP)的 DEA緩沖液中，測定了不同吸附時間下405 nm的光吸收值、從測得的p.NP濃度與光吸收值曲線(圖1)看出:在含0. 6 mmol/L底物的DEA緩沖液中,微球對產物pNP在15 min內的吸附影響比在高濃度底物(15mmol/L>溶液中大得多、所得曲線嚴重漂移、已不呈直線．這說明微球對pNPP和pNP都有吸附作用．在測定固相酶的活力時需考慮底物濃度對光吸收曲線的影響．當加入底物pNPP的濃度為15 mmol/L時(遠大于加入產物pNP的含量),滅活的載酶胺化微球對pNP仍有明顯的吸附作用．而且在一定時間內隨吸附時間的延長,吸附量加大.

從圖1中看出，隨著吸附時間延長曲線的線性關系發生變化,吸附2h后在含pNP濃度較低的溶液中微球仍有一定的吸附力;而在濃度較高的溶液中吸附已接近飽和,表現為與吸附45 min 的曲線重臺,由此可見微球對pNP的吸附有個**值.

吸附時間對微球吸附pNP和pNPP也有影響．從圖2看出，盡管吸附水平不同，但在溶液中不加底物pNPP與加入0.6 mmol/L和15 mmol/L pNPP的3種條件下，吸附曲線都在吸附15 min時接近飽和。吸附2h基本飽和.

微球對pNPP和pNP吸附作用的原因:一個是由于固載堿性磷酸酶所用胺化聚苯乙鐸微球為交聯型﹐酶分子通過戊二醛與做球表面的氨基交聯，微球內部的大部分氮基在堿性溶液中形成NHOH-形式，具有一定的離子交換能力，帶負電性小分子pNPP 和 pNP通過異性電荷吸引及離子交換促進吸附﹔另一個是胺化苯乙烯微球的疏水骨架與含苯環的產物和底物之間具有一定的疏水力，也促進了吸附.

載體對底物和產物的吸附導致堿性磷酸酶固定化后米氏常數減小(圖3)，這是因為微球載體對底物的吸附能力影響了底物的分配效應1．分配效應以分配系數(p)來描述:p=S./S(式中S;和S分別表示底物在微環境中的局部濃度和客觀體系中的總體濃度).

在消除了外擴散限制的影響后,分配效應影響改變了固相酶的的Km值(K'm一Km/p).

本文研究的載體和底物帶相反電荷，p>1，從原理上講固定化酶的K'm小于游離酶Km實驗結果證實了上述推斷．靜電作用使微環境中底物濃度比總體濃度高，Km減小，酶催化反應的速度加快﹔另外，底物和載體間的疏水作用也會改變分散系數，使酶促反應加快.

載酶微球的吸附效應對酶催化反應也有負作用，這表現在產物積累影響催化反應上.在微球表面的酶分子催化底物pNPP轉化為pNP后，pNP積累于酶分子周圍，如果不能及時擴散，可能造成產物的竟爭性**(．因為載酶微球對底物和產物具有吸附瑰象，會造成標準吸收曲線的漂移，所以在固相酶活力測定時要考慮這種現象對實際活力的影響．此外，載酶微球的底物和產物的吸附現象有利于固相酶在免疫檢測等顯色反應中的應用.

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zl 2021.02.22