齊岳生物致力于為廣大研究人員提供的外泌體研究解決方案。齊岳生物不僅自主研發(fā)了外泌體提取試劑盒，還提供包括外泌體超速離心、外泌體NTA分析、外泌體透射電鏡拍攝、外泌體標(biāo)志物蛋白Western Blot鑒定、外泌體蛋白質(zhì)譜分析、外泌體分泌蛋白篩選、外泌體microRNA篩選、外泌體lncRNA篩選、外泌體RNA定量檢測、外泌體示蹤、外泌體細(xì)胞功能檢測、外泌體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等一系列服務(wù)環(huán)節(jié)的“一站式”外泌體服務(wù)體系，我司將為廣大用戶提供外泌體研究多方位的便利與支持。

外泌體是40-180 nm大小的細(xì)胞外囊泡，由各種類型的細(xì)胞廣泛分泌，包括細(xì)胞，免疫細(xì)胞，干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等。它們?cè)陂L距離和短距離的細(xì)胞間通信中起著至關(guān)重要的作用。有研究在來源的外泌體膜中發(fā)現(xiàn)了各種特定的表面粘附分子，它們介導(dǎo)了對(duì)同源細(xì)胞的靶向，同時(shí)外泌體膜上高表達(dá)的CD47蛋白可以幫助外泌體逃脫巨噬細(xì)胞的吞噬作用。據(jù)我們所知，此前還沒有外泌體膜包被仿生納米顆粒靶向清除CTCs并轉(zhuǎn)移的報(bào)道。外泌體膜修飾的策略可以幫助納米粒子規(guī)避巨噬細(xì)胞的吞噬作用，并靶向原發(fā)，識(shí)別CTCs。

外泌體膜包載仿生前藥納米系統(tǒng)的制備與表征

通過單硫醚鍵將亞油酸與PTX偶聯(lián)來制備ROS敏感的PTX前藥（圖1）。使用乳液溶劑蒸發(fā)法將PTX-S-LA和CuB共裝載到PEG-PCL納米粒子中，以制備PCNP，其中P表示PTX-S-LA，C表示CuB。然后將PCNP與EM孵育以獲取EMPC。相同的處理方法制備分別裝載有PTX-S-LA或CuB的EMP或EMC。下圖2顯示了PCNP的流體動(dòng)力學(xué)直徑和形態(tài)，它們具有規(guī)則的球形形狀，平均大小接近80 nm。PTX-S-LA和CuB在PEG-PCL納米顆粒中的載藥量分別為9 wt％和5 wt％，包封率分別為87.6％和69.2％。

使用梯度離心法提取外泌體。通過透射電子顯微鏡（TEM）成像探究外泌體的碟狀結(jié)構(gòu)，以及針對(duì)特征性外泌體標(biāo)記物TSG101，CD9和CD81的蛋白質(zhì)印跡分析，表明外泌體已成功分離。EMPC是通過對(duì)提取的外泌體進(jìn)行低滲處理來制備的。將PEG-PCL納米顆粒與EM進(jìn)一步孵育以制備EMPC。通過降低的zeta電位，增加的粒徑（?100 nm）和TEM圖像證明PEG-PCL納米顆粒表面上EM的成功包被。

為了檢查仿生外泌體納米顆粒殼上膜蛋白的存在，按以前的報(bào)道進(jìn)行了十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)。膜蛋白標(biāo)記的SDS-PAGE蛋白檢查表明，在仿生外泌體納米顆粒的蛋白質(zhì)譜中，保留了從EM繼承的獨(dú)特蛋白。CD44和CD47對(duì)于轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。CD44是MDA-MB-231細(xì)胞上的表面粘附分子，在CTC與轉(zhuǎn)移灶的粘附中起關(guān)鍵作用。CD47可以保護(hù)細(xì)胞免受巨噬細(xì)胞的吞噬作用，吞噬作用與的侵襲有關(guān)。如圖2D所示，它們共存于**細(xì)胞膜和EM上，并在EMPC中保存良好，以介導(dǎo)同型**細(xì)胞靶向。

然后，用DiI（紅色）標(biāo)記EM，并用香豆素6（C-6，綠色）標(biāo)記疏水核心，以檢查EM完全覆蓋PEG-PCL納米顆粒。將雙標(biāo)記的納米顆粒添加到MDA-MB-231細(xì)胞中2 h，并用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）觀察。如圖2E所示，DiI的熒光與C-6的熒光共定位，表明外泌體仿生納米顆粒在細(xì)胞攝取一段時(shí)間后可以保留結(jié)構(gòu)完整性。

接下來，我們研究了C-6標(biāo)記的PEG-PCL納米顆粒（C-6 NPs），C-6標(biāo)記的紅細(xì)胞膜包被的PEG-PCL納米顆粒（RM @ C-6 NPs）和C-6標(biāo)記的在MDA-MB-231，MCF-7和NIH 3T3細(xì)胞中包被外泌體的納米顆粒（EM @ C-6 NPs），以確認(rèn)外泌體仿生納米顆粒的同型**細(xì)胞靶向能力。進(jìn)行了紅細(xì)胞膜對(duì)PEG-PCL納米粒子的修飾，以驗(yàn)證EM上的蛋白質(zhì)在促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)在化方面的關(guān)鍵作用。如圖3A所示，C-6 NPs和RM @ C-6 NPs的C-6熒光比EM @ C-6 NPs的熒光低，這表明細(xì)胞攝取的提高歸因于外泌體上的蛋白質(zhì)。同時(shí)，將MCF-7和NIH 3T3細(xì)胞設(shè)為陰性對(duì)照，這進(jìn)一步說明，用EM修飾納米顆?？商貏e增強(qiáng)同一來源**細(xì)胞的內(nèi)在化。然后用流式細(xì)胞儀檢測靶向作用的定量。如圖3B所示，在MDA-MB-231細(xì)胞中，EM @ C-6 NP的熒光信號(hào)比C-6 NP和RM @ C-6 NP的熒光信號(hào)高3.5倍。相比之下，與C-6 NP和RM @ C-6 NP相比，EM @ C-6 NP在MCF-7和3T3細(xì)胞中未顯示熒光增強(qiáng)。以上提到的所有結(jié)果表明，仿生外泌體納米顆粒對(duì)同型**細(xì)胞具有選擇性親和力。

然后，驗(yàn)證了外泌體上的CD47對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力的作用。將接種于12孔板的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞與C-6 NP，RM @ C-6 NP和EM @ C-6 NP孵育。如圖4C所示，RM @ C-6 NP和EM @ C-6 NPs表現(xiàn)出比C-6 NPs低得多的內(nèi)在化。對(duì)于流式細(xì)胞儀定量分析，與RM @ C-6 NP和EM @ C-6 NP相比，C-6 NP的熒光強(qiáng)度增加了3.1倍。結(jié)果證實(shí)，RM和EM上的CD47均可巨噬細(xì)胞的吞噬作用。

結(jié)論：

將ROS敏感的單硫醚鍵連接的紫杉醇-亞油酸前藥（PTX-S-LA）和葫蘆素B共同封裝到PEG-PCL聚合物中制得雙載藥膠束，并進(jìn)一步用細(xì)胞衍生的外泌體膜修飾，制備外泌體樣序貫活化仿生前藥納米平臺(tái)。該制劑不僅地靶向原發(fā)，而且特異性捕獲清除CTCs，從而**了轉(zhuǎn)移。細(xì)胞攝取后，納米粒將**釋放出葫蘆素B，從而通過FAK / MMP信號(hào)通路調(diào)節(jié)**阻斷**細(xì)胞的粘附，遷移和侵襲并轉(zhuǎn)移。同時(shí)，釋放的葫蘆素B增加了細(xì)胞中的ROS水平，級(jí)聯(lián)促進(jìn)了PTX-S-LA前藥的活化，起到一石二鳥的作用。該制劑表現(xiàn)出了出色的CTCs靶向能力、增強(qiáng)的前藥活化、延長的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間、更多的蓄積和更深的瘤內(nèi)滲透，在原位和異位MDA-MB-231模型中均表現(xiàn)出出色的原發(fā)性和抗轉(zhuǎn)移活性。