由于現有的熒光底物種類較少,迫切需要出現更多種類且廉價的酶底物來解決這些問題。Bissell等報道了7-氨基-4-三氟甲基香豆素的合成及其與氨基酸的酯化,指出該類化合物具有較好的應用前景。AFC[7-氨基-4-三氟甲基香豆素]是許多AFC酶底物的前體物質,同時也被用作以AFC為基礎的酶底物的校準標準液。大量的研究結果表明,較之于AMC[7-氨基4-甲基香豆素]酶底物,AFC的熒光底物所產生的AFC比AMC具有更長的吸收和熒光波長。脯氨酸氨肽酶和丙氨酸氨肽酶是微生物體內常見的兩種酶，但是利用這兩種酶去水解AFC為基礎的酶底物用于微生物檢測還沒有相關文獻的報道。本文在合成兩種新型氨肽酶底物用于微生物的檢測。合成方法是以間氨基酚,三氟乙酸乙酯為原料一步反應得到7-氨基4-三氟甲基香豆素( AFC),再以AFC為原料分別與Boc-Pro-OH , Boc-Ala-OH反應,再經脫保護基得到氨肽酶底物。其合成路線如下所示。

實驗步驟

步驟一：7-氨基-4-三氟甲基香豆素(AFC)的合成

步驟二：1.3 Ala-7-氨基-4-三氟甲基酶底物的合成

（1）Boc-Ala-7-氨基4-三氟甲基的合成

（2）Ala-7-氨基-4-三氟甲基酶底物的合成

步驟三：Pro-7-氨基-4-三氟甲基氨肽酶底物的合成

步驟四：Boc-Pro-7-氨基-4-三氟甲基的合成

（1）二氯三苯基膦的合成

（2）肽的合成

（3）Pro-7-氨基4-三氟甲基氨肽酶底物的合成

結果

Boc-Ala-7-氨基-4-三氟甲基選用**的Steg-lich酯化反應,反應步驟比較簡單,但反應時間較長而且生成的副產物DCU較難處理干凈。因此在合成Boc-Pro-7-氨基4-三氟甲基時,利用二氯三苯基膦為催化劑,但由于三苯基膦與六氯乙烷合成磷肽的反應有明顯的溶劑效應,在二氯甲烷中反應很快,因此利用三苯基膦與六氯乙烷在二氯甲烷溶液中生成二氯三苯基膦,再與保護的氨基酸反應生產混酐,不但能使羧酸活化,而且有很好的區域選擇性,在胺的親核進攻下能惟一的生成酰胺,該反應的產率較高,而且大大縮短了反應時間。但由于二氯三苯基膦的活潑性高,易水解,因此只有在使用時才制備,而且反應過程中要注意密閉性。在脫Boc-保護基反應完成后,要先旋蒸除去大部分三氟乙酸,再用飽和NaHCO，來中和至中性。此反應的副產物都為氣體,后處理簡單。

從Ala-7-氨基-4-三氟甲基氨肽酶底物CNMR譜圖上,可以看到由于三氟甲基的存在，氟對鄰近的碳有影響,對相鄰的碳影響大,碳峰縮小而且距離較遠,在8 120.11 ~122.81(C-10)出現明顯的裂分,分開為兩個單峰;對C-3影響稍小,出現同高度的縮小的四重峰,在8140.97位置。從"3CNMR 、'HNMR譜圖可以確認 Ala-7-氨基-4-三氟甲基氨肽酶底物的結構。

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