目前市場上基于酶底物檢測方法主要是顯色培養基法和熒光檢測法。本文合成了一種新型半乳糖酶底物1，可以通過與氣相色譜聯用技術來快速檢測病源微生物。酶底物1的合成路線如圖1所示,以五乙酰半乳糖2為原料,經溴代,親核取代、還原和脫保護等5步有機反應，總產率為56.1% ,高產率高選擇性得到目標酶底物。

圖1酶底物1合成路線。

實驗

實驗步驟

步驟一：1-溴-2,3,4,6-O-四乙酰基-3-D-半乳糖2的合成

步驟二：2,3,4,6-O-四乙?；?/span>-1-O-(4-甲酰基苯氧基)-3-D-半乳糖3的合成

步驟三：2,3,4,6-O-四乙?；?/span>-1-O-(4-羥甲基苯氧基)-B-D-半乳糖4的合成

步驟四：半乳糖綴合物5的合成

步驟五：半乳糖苷酶底物1的合成

結果與討論

該酶底物1可被微生物分泌的半乳糖酶水解，發生斷裂糖苷鍵釋放出苷元a。苷元a化學性質非常不穩定,在緩沖液中會自發斷裂釋放出一分子二甲胺、二氧化碳和4-羥甲基苯酚,其水解原理如圖2所示。二甲胺在室溫為帶有氨味的氣體,通過與氣體檢測儀如氣相色譜聯用可以靈敏監測酶底物的水解動態,從而可以進一步發展為微生物檢測技術。

在合成過程中,對化合物4的合成方法進行了優化,發現采用LiAIH副產物較多,KBH存在反應不完全現象，只有NaBH4和THF體系反應效果更好。化合物5的合成過程中,曾采用固體三光氣做為偶聯活化試劑,將二甲胺和化合物4偶聯,發現反應控制較難，會有大量副產物生產，產率只有28%。故改用二甲氨基甲酰氯為反應試劑,產率大幅度提升,產率高達82%。總之,本文報道了一種新型半乳糖糖苷酶底物的合成方法,采用價廉易得的五乙酰半乳糖為起始原料,通過五步有機合成反應得到目標產物,總產率高達56.1%。合成方法具有操作簡便,產率高和選擇性強等優點,并對半乳糖苷酶底物1的水解機理進行了探討,其相關生物檢測部分將有待進一步研究。

圖2 半乳糖苷酶底物的水解。

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以下為部分產品列表

Ac-IETD-R110

Ac-DEVD-AMC

2',7'-二氯熒光素二乙酸酯

Dihydrorhodamine 123, dihydrochloride salt

二氫若丹明123

二氫乙錠

CF640R Tyramide

CF594 Tyramide

CF568 Tyramide

CF543 Tyramide

CF488A Tyramide

CF350 Tyramide

Biotin-XX Tyramide

2,2'-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽

10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine

氯化硝基四氮唑蘭

4-甲基傘形酮磷酸二鈉鹽三水

MUP, free acid

1, 6-二磷酸果糖鈉

Chromogenic Phosphatase Substrate Sampler

5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯對甲苯胺鹽

BCIP Red

BCIP Pink

XTT 鈉鹽

Resorufin (high purity)

Resazurin, Sodium Salt

噻唑藍

2,3-二(4-甲基苯基)-1H-四唑-3-鎓-5-甲腈氯化物

5-溴-4-氯-3-吲哚-Β-D-纖維二糖糖苷

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