辣根過(guò)氧化物酶是一種糖蛋白,由于其穩(wěn)定性好、分子量小、比活性高、特異性強(qiáng)和易于分離提純等特點(diǎn)，廣泛用于酶免疫分析中作為標(biāo)記物．測(cè)定HRP的活性可以間接確定體液或其它組織液中待測(cè)抗原或抗體的量．因此，HRP的測(cè)定對(duì)免疫學(xué)和組織化學(xué)的研究以及臨床疾病的診斷具有很重要的意義.

HRP的測(cè)定目前常用催化光度法,其靈敏度較低，作為底物的鄰苯二胺又具有潛在的致**作用．近年來(lái)，基于HRP催化Luminol-HgO。化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(CELISA)靈敏度很高"，但在通常使用的固相吸附法中，是在固相表面測(cè)量化學(xué)發(fā)光，重現(xiàn)性較差．另外血清樣品中某些蛋白質(zhì)的非特異性吸附,導(dǎo)致背景信號(hào)的升高和信噪比的降低，使其測(cè)定靈敏度較之放射免疫分析仍有遜色.

本文提出一種HRP及其標(biāo)記物的新的化學(xué)發(fā)光測(cè)定方法--一-偶合反應(yīng)化學(xué)發(fā)光分析法，該法將HRP催化HgO氧化KI生成I的反應(yīng)與工uminol-Ig的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)偶合起來(lái)，根據(jù)發(fā)光強(qiáng)度確定HRP及其標(biāo)記物的量．此法測(cè)定HRP(RZ=2.5-3)的線性范圍是10—6000 pg(或0.25-150 fmol),檢測(cè)下限為7pg(或0.18 fmol)，對(duì)20 pg HRP進(jìn)行11次乎行測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.5%、與HRP催化Luminol-HpO。法比較，測(cè)游離HRP的靈敏度提高3倍，測(cè)HRP標(biāo)記物的靈敏度提高10—100倍，能與放射免疫分析相媲美，且克服了上述固相吸附法直接測(cè)定HRP的缺陷,提高了測(cè)定的選擇性.

實(shí)驗(yàn)

儀器和試劑  LKB-1250發(fā)光光度計(jì)；ModelSA 720酸度計(jì);微量取樣器(50、100、200、500 uL);酶聯(lián)免疫吸附板.Luminol溶液(5.0×10~3moL·dm~3):用0.1 moEdm-8NaHCOg-NaOH溶液容解配制;KI溶液: 2.0×10~3 moL-dm-3，HgO溶液:2.0×10-* moLdm3;HR溶液(1.0:10g-mL-1)、稱(chēng)取100 mg HRP(RZ=2.5—3),溶解后,用蒸餾水稀釋至100 mL，4℃冰箱保存．使用時(shí)用蒸餾水逐級(jí)稀釋;HRP的乙型肝炎抗原和抗體等的標(biāo)記物:HBsAg-HRP、HBsAb-HRP、HBoAb-HRP、PHSAR-HRP。

操作步驟  于26 mL容量瓶中先加入約10mL水后，加入1.0mL EDTA溶液(1.0 g·mL-1),2.5 nL2,0×10~3 moLdm-3KI溶液，2.5 mL 2.0×10~moL·dm-3Hg0浴液,用水稀釋至標(biāo)線,搖勻備用.

用微量取樣器吸取上述溶液200 pL于酶聯(lián)免疫吸附板中，加入100 pL HRP(或其標(biāo)記物),室溫暗處放置20 min后,取此溶液100 puL放入LKB-1250發(fā)光光度計(jì)反應(yīng)室，從儀器加液處加入500 uL5.0×10-3 moL·dm-3 Luminol，記錄反應(yīng)所產(chǎn)生的光信號(hào)強(qiáng)度，同時(shí)作空白試驗(yàn)后,繪制發(fā)光強(qiáng)度與HRP濃度間的關(guān)系曲線.

結(jié)果與討論

偶合反應(yīng)的時(shí)間特性 偶合反應(yīng)的速度受酶促反應(yīng)速度和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)速度兩者影響,在堿性介質(zhì)中，低濃度的碘氧化Luminol的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)屬于快速的雙電子氧化的一級(jí)反應(yīng)2,其反應(yīng)機(jī)理為

記錄的化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線(圖1)顯示出它屬于一種延滯性的快速化學(xué)發(fā)光，達(dá)到發(fā)光峰值的時(shí)間為1.5s，所以控制偶合反應(yīng)的主要因素是酶催化HgO氧化KI生成I。的反應(yīng)，由圖2可見(jiàn),這一反應(yīng)經(jīng)歷兩個(gè)階段,在反應(yīng)開(kāi)始階段(圖中曲線0A段)，底物分子和酶分子的催化活性中心未能充分接觸，故此時(shí)生成Iz的速度較慢;隨反應(yīng)進(jìn)行，所有酶的活性中心都參予了反應(yīng),生成I2的速度迅速增加(曲線AB段)，且與反應(yīng)時(shí)間呈線性關(guān)系，因而可以控制一-定的反應(yīng)時(shí)間(如20 min)進(jìn)行測(cè)定.

偶合反應(yīng)的條件

酶促反應(yīng)的pH值﹐研究了HR催化Hg0z氧化KI生成I的反應(yīng)中p互值的影響(圖3)，發(fā)現(xiàn)在pH3.5—3.7范圍內(nèi)有較大的催化活性，而I2氧化Luminol的反應(yīng)則以pH10為佳.

圖1 Laminol-化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線

圖2偶合反應(yīng)的時(shí)間特性

圖3 酶促反應(yīng)pH值影響

Laminol溶液的濃度 Luminol溶液濃度以及所處介質(zhì)對(duì)Luminol-I2的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)影響較大,研究結(jié)果表明,在0.1 mo L-dm-3 NaHCOg-NaOH介質(zhì)中,選用5.0×10-8moL-dm-3 Luminol濃度,能獲得更大的發(fā)光信號(hào).

H2O2與 KI溶液的濃度 對(duì)H2O2與KI的適宜測(cè)定濃度進(jìn)行了試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)H2O2濃度為2.0×10-5 moL-dm-8、KI溶液濃度為2.0×10-4moL-dm-3時(shí),有利于這一測(cè)定的進(jìn)行.

蛋白質(zhì)濃度的影響 為了模擬人血清的干擾，我們用牛血清白蛋白代替人血清考察了其加入量對(duì)化學(xué)發(fā)光信號(hào)的淬滅影響.結(jié)果表明,隨反應(yīng)混合物中蛋白質(zhì)濃度增加,化學(xué)發(fā)光信號(hào)逐漸減弱,當(dāng)其濃度大于0.2 mg.mL1時(shí),化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度接近零．這種蛋白質(zhì)對(duì)化學(xué)發(fā)光信號(hào)的淬滅作用是均相免疫測(cè)定的重要障礙，但對(duì)酶聯(lián)免疫固相吸附法無(wú)影響.

EDTA濃度 EDTA可以掩蔽試劑及水中痕量雜質(zhì)對(duì)測(cè)定的影響,降低空白信號(hào)，因而在測(cè)定溶液中加入少量EDTA對(duì)測(cè)定靈敏度有利,但EDTA量大時(shí)對(duì)化學(xué)發(fā)光信號(hào)有淬滅作用，兼顧兩者的影響，我們選用1.6—3.2×10~*g-mL-1 EDTA為合適濃度.

HRP濃度與發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系 在上述適宜條件下測(cè)定不同濃度HRP時(shí)的化學(xué)發(fā)光峰值信號(hào)，繪制工.作曲線(圖4),在10-6000 pg(或0.25—-150 fmol)HRP范圍內(nèi)符合直線關(guān)系，檢出限為7pg(或0.18 fmol)，對(duì)20 pg HRP進(jìn)行11次平行測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.5%(表1).

直接催化反應(yīng)與偶合反應(yīng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定HRP及其標(biāo)記物的比較研究 HRP直接催化Luminol-HgOg的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)測(cè)定HRP的靈敏度還不夠高（與偶合法比較）,這主要是受到反應(yīng)條件的限制．HRP催化作用的pH值是中性或弱酸性條件,而Luminol化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在pH10左右量子產(chǎn)率高.因此,若在酶的適宜活性條件下測(cè)定,發(fā)光反應(yīng)量子產(chǎn)率低,測(cè)定靈敏度不高;反之,若在發(fā)光反應(yīng)條件下測(cè)定，由于HR在堿性條件下不穩(wěn)定,催化活性中心易破壞而使催化能力喪失,亦得不到靈敏的測(cè)定結(jié)果.

本文提出的偶合反應(yīng)成功地解決了這一難題．因?yàn)?/span>HgO:-KI的反應(yīng)正是在HRP反應(yīng)pH值條件下進(jìn)行的，而產(chǎn)物I與Luminol的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的p互條件恰好亦是Luminol量子產(chǎn)率高的條件，另外發(fā)光反應(yīng)測(cè)定I的靈敏度本身就很高(檢出限為10-9nol.dm—3),此法實(shí)際上又是兩種催化反應(yīng)的偶合,比它們中任何一個(gè)單獨(dú)催化反應(yīng)的靈敏度要高得多.

對(duì)于HRP標(biāo)記物的測(cè)定,兩類(lèi)方法靈敏度的差別更為突出．和其它酶一樣，HRP的活·性中心只是其分子的一部分,它存在于分子表面，當(dāng)其與底物接觸時(shí)起催化作用，考察這一催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)可知,其催化反應(yīng)的速度受兩個(gè)因素控制:1．?dāng)U散速度為底物擴(kuò)散至酶的活性中心表面,與酶的活性中心接觸,反應(yīng)后,產(chǎn)物再?gòu)拿副砻鏀U(kuò)散至溶液中;2．酶促反應(yīng)速度為底物與酶的活性中心接觸后,在酶的參與下進(jìn)行反應(yīng)的速度．當(dāng)HRP處于游離態(tài)時(shí),活性中心暴露在分子表面,底物分子很容易與其接觸，因此催化反應(yīng)速度僅取決于**個(gè)因素，符合Michaelis-Menten方程;但是,當(dāng)HRP被標(biāo)記到一個(gè)大分子蛋白質(zhì)上后,由于空間位阻效應(yīng),使HRP的活性中心與底物的接觸受到阻礙，由于擴(kuò)散需要一定時(shí)間，而化學(xué)發(fā)光反應(yīng)速度很快,底物加入的瞬間發(fā)光強(qiáng)度即達(dá)更大,因而僅有部分酶與底物接觸,參與化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，故靈敏度不高.

偶合反應(yīng)克服了上述動(dòng)力學(xué)過(guò)程對(duì)測(cè)定的影響,它先使Hg0與KI底物與標(biāo)記物經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的充分接觸，再加入工uminol測(cè)定I的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，因而使HRP標(biāo)記物的測(cè)定靈敏度大大提高．表2列出采用偶合反應(yīng)和直接催化反應(yīng)化學(xué)發(fā)光法測(cè)定HRP及其標(biāo)記物的結(jié)果.

研究表明,無(wú)論是測(cè)定游離HRP還是其標(biāo)記物,利用偶合反應(yīng)化學(xué)發(fā)光分析法測(cè)定的靈敏度均高于直接催化法,因而能很好地用于化學(xué)發(fā)光酶免疫分析中。

部分相關(guān)產(chǎn)品列表

HRP-Bodipy(BDP) 氟化硼二吡咯

HRP-IR825

HRP-HMME血卟啉單甲醚

HRP-Ce6  二氫卟吩

HRP-PLGA

HRP-PCL 聚已內(nèi)酯

HRP-PLA 聚乳酸

HRP-PAA 聚丙烯酸

HRP-PS 聚丙乙烯

HRP-PEI 聚乙烯亞胺

HRP-PAMAM樹(shù)枝狀聚酰胺

HRP-PNIPAAm聚N-異丙基丙烯酰胺

HRP-BSA   牛血清白蛋白

"HRP-HAS  人血清白蛋白 "

HRP-Transferrin 轉(zhuǎn)鐵蛋白

HRP-Wheat germ agglutinin(WGA) 小麥胚凝集素

HRP-Streptavidins 鏈霉親和素

HRP-Heparin 肝素

HRP-Concanavalin A  刀豆球蛋白

HRP-Catalase   過(guò)氧化氫酶

HRP-Insulin  胰島素

HRP-Casein 絡(luò)蛋白

HRP-Ovalbumin 卵清蛋白

HRP-Lectins 凝集素

HRP-Dextran  葡聚糖 右旋糖酐

HRP-Lysozyme 溶菌酶

HRP-alginate  海藻酸鈉

HRP-Chitosan 殼聚糖

HRP-galactose  半乳糖

HRP-mannose  甘露糖

HRP-Glucose  葡萄糖

HRP-Lactosyl   乳糖基

HRP-Xanthan  黃原膠

HRP-Fucoidan  巖藻多糖

HRP-Xylan   木聚糖

HRP-Cellobiose  纖維二糖

HRP-Lentinan  香菇多糖

HRP-Chondroitin sulfate硫酸軟骨素

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