電化學酶聯免疫分析法是將酶免疫分析法同電化學分析結合的一種分析方法,既有免疫分析的高特異性,又有電分析化學的高靈敏度。近年來,電化學酶聯免疫分析法得到了越來越多的重視"，常用的方法有流動注射分析安培法[2~$、線性掃描伏安法[6~8等。以伏安法檢測酶反應的產物,是一種比較快速簡便的方法。

辣根過氧化物酶(HRP)是常用的標記酶之一,對HRP測定的關鍵是選擇合適的底物體系,以達到較好的靈敏度和檢出限。常用底物的穩定性較差，見光或空氣極易被氧化,使得底物的保存及體系的靈敏度受到了限制。近年來,文獻{報道了以鉻黑T為HRP的底物光度法檢測HO，文獻報道了以酸性鉻藍K為HRP的電化學底物,用于HRP的測定。本文發現HRP可促進HO2氧化甲基紅的反應,且在一定條件下,甲基紅可產生良好的伏安峰,據此建立了測定HRP的酶聯伏安分析方法,用于HRP和IgGHRP、Avidin-HRP的測定。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

DS-2005伏安極譜儀，采用三電極系統,靜汞電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極,鉑電極為對電極;PHS-3C精密pH計。

辣根過氧化物酶(HRP,> 250 U mg，上海雪滿生物科技有限公司):準確稱取0.0100 g HRP,溶解并定容至10 mL，得質量濃度為1.0×10-3g mL4℃冰箱保存,使用時逐級稀釋;Hz02:4.0×10 3mol h，用時現配;1.00 mg mL甲基紅:準確稱量甲基紅0.0500 g,用乙醇溶解并定容至50 mL,使用時再稀釋至工作濃度;0. 04 molL Briton-Rob-inson (B一R)緩沖溶液: pH值為4.35。

1.2實驗方法

于5 mL比色管中，依次加入0.20 mL 0. 10mg mL甲基紅,1.50 mL B一R緩沖溶液,2.0 mL 4.0×10 3 molL HO2溶液，一定量的HRP，二次水定容到5 mL，室溫下放置10 min后，以Eo=-0.2 V為起始電位，靜止時間為5 s,掃描速率為0.3 V /s進行陰極化掃描,記錄線性掃描二階導數伏安圖(圖1)，記錄峰電流(Ip)，同時做空白(lo)，以△I=(Io一Ip)值進行定量。

2 結果與討論

2.1酶催化反應條件

HRP的反應活性與緩沖溶液的pH值有密切

的聯系,考察了溶液pH值對嗨催化反應的影響，當pH值在4.10~4.56之間對酶催化反應更有利,所以選擇pH 4.35的B一R緩沖溶液作為介質,且發現在5 mL試管中加入1.5 mL pH 4.35 B一R緩沖溶液后,可以得到更大且穩定的極譜峰電流;同時考察了緩沖溶液的濃度和甲基紅的濃度對反應的影響,其更好用量分別為2.0 mL 4.0×103molLHO2,0.20 mL 0.10 mg mL甲基紅。反應時間的影響試驗表明，在室溫下反應10 min,測量信號穩定﹑精密度好且△I更大。

2.2伏安曲線特性

由圖1可見HRP能催化氧化還原反應的發生,使甲基紅被氧化分解,其平衡濃度降低,對應的還原峰電流降低。考察了在pH 為4.35的B一R緩沖介質中的伏安行為，靜止時間的影啊買驗衣明,在3~9 s的靜止時間內,隨著時間的延長,峰電流有所增加,實驗選擇靜止時間為5 s;隨著起始電位的負移,峰電流值減小,實驗選擇起始電位為—0.2 V;當掃描速率在0.05~0.30 Vl變化時,當掃描速率為0.3 V s時,峰電流大,因此實驗選擇0.3 Vk進行掃描。循環伏安曲線表明(如圖2)，在—0.51 V處有一還原峰,而無對應的氧化峰,說明電極過程是不可逆的。且進行多次循環掃描時,峰電流逐漸減小,可見該伏安峰受吸附控制。綜上所述,此伏安過程是受吸附控制的不可逆過程。

2.3 HRP及其標記物的測定

在選定的實驗條件下，加入不同量的HRP,繪制HRP質量濃度和峰電流的關系曲線,結果如圖3所示,HRP在5.0×10-8~5.0× 10 7g hmL之間與△Ⅰ呈線性關系，其線性回歸方程為:△Ip(A)=1545.3p(× 107g mL)＋ 107.6，相關系數r=0. 9971。對2.0×107 g hmL HRP進行11次測定的相對標準偏差為4.6%,方法的檢出限為1.8×10 8g mL。

應用本體系對羊抗兔(IlgG-HRP)標記物進行測定,線性范圍為3.3×10-8~4.9×10'g mL(如圖4所示)。其線性回歸方程為:-Ip('A)=352.7P(1.64×10°g mL)—91.82,相關系數r=0.9953。

同樣本體系應用于Avidin-HRP的測定，Avidin-HRP的稀釋比在16250~1*50000之間與△Ⅰ呈線性關系(如圖5),更大稀釋比為1*50000,相關系數r=0.996。

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