分離純化-單克隆抗體的七個步驟(含抗體標記定制產品)

　　一般的單克隆抗體的純化工藝中主要是采用色譜分離技術的，這個技術也就是常說的層析分離法(Chromatography)。通過層析分離后的收獲液，再加上輔料，就變成了常說的原液了。一般的說，層析分離主要是指親和層析(AC)、陽離子交換層析(CEX)和陰離子交換層析(AEX)。

　　分離純化步驟

　　一、親和層析:免疫吸附,捕獲目的蛋白

　　分離純化中主要的幾個步驟是層析分離，分離純化其實就是載量比較大的液相色譜是個用于生物制品的制備液相。通常的，會把親和層析叫做粗純，將陽離子交換層析和陰離子交換層析叫做精純，下面我們先看看親和層析。親和層析的原理，就是依靠填料對單克隆抗體的特異性吸附，捕獲單抗。大概就是下面圖里(圖1)這個原理：

　　二、低pH值孵育:殺滅病原體

　　這是個排在親和層析之后，陽離子交換層析之前的步驟。主要的目的是要去除病毒和其他一些病原體。

　　三、陽離子交換層析:離子交換，純化目的蛋白

　　低pH值孵育處理后，就要開始陽離子交換了。親和層析獲得的洗脫液，只是初步純化的產物，陽離子交換后，很多雜蛋白就被去掉了，尤其是親和層析時從填料上脫落一些Protein A蛋白，在這一步也能被很好的去除。陽離子交換的原理，簡單地說就是用帶正電的單抗替換掉填料上的陽離子，其他的雜蛋白和雜質都隨穿透液流走了，再用更強離子強度的離子從填料上替換掉單抗，收獲液中就可以得到更純的單抗了。基本上就是下圖這個原理(圖2)：

　　四、陰離子交換層析:離子交換，去除雜質

　　經過陽離子交換，雜蛋白基本去除了，剩下的一些DNA、內毒素和其他雜質，可以用陰離子交換的方式去掉。陰離子交換的原理也是同種電荷替換，與陽離子交換原理接近(如圖)

　　五、納濾:過濾去除病毒

　　陰離子交換后，就要進行納濾除病毒，大概原理就是(下圖)這個原理，基本可以理解為是個孔徑很小的，小到可以濾掉病毒的過濾：

　　六、超濾濃縮和洗濾置換

　　1.超濾濃縮:濃縮蛋白至特定濃度

　　2.洗濾置換:置換蛋白緩沖液至特定緩沖體系

　　納濾后的液體需要再經過UF/DF處理，這里面要分成兩個步驟：一是UF，也就是超濾濃縮，因為經過陰離子交換和納濾之后，收獲液被大大的稀釋了，目的蛋白的濃度已經不適合用于制劑灌裝了，需要通過超濾的方式進行濃縮，達到適合灌裝的濃度;二是DF，也就是洗濾置換，也就是要把含有蛋白的緩沖液體系，從經過一系列純化和過濾后，已經變的亂七八糟的組分換成可以配制成原液的組分。

　　無論是UF還是DF，基本原理都是切向流，大概的原理見下圖

　　七、原液配制:加入輔料，形成原液

　　經過以上一些列操作，雜質和病原體被去除了，蛋白質濃度也適宜了，緩沖體系也符合要求了，再加上輔料，就可以成為能用于灌裝的原液了。

　　總而言之，分離純化的目的就是把經過細胞培養而得到的，組分復雜的發酵收獲液，經過一系列層析分離、過濾、超濾、洗濾、添加輔料等處理，使之成為能夠用于制劑生產的原液。

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　　辣根過氧化物酶(HRP)標記抗AFP鼠單克隆抗體

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