用熒光探針對特定的靶蛋白（POI）進行標記已經成為研究蛋白表達、定位和轉運的主要方式之一。然而，用于標記的熒光探針多數是“always-on”型的，這限制了其廣泛應用。因此，設計合成”turn-on”型熒光探針用于特定蛋白的標記已成為一個研究熱點。

近日，加拿大渥太華大學的Jeffrey W. Keillor教授課題組設計合成了雙馬來酰亞胺熒光團4（又名YC23），該分子以氟硼二吡咯（BODIPY）為基本骨架，連接上雙馬來酰亞胺后，其光誘導電子轉移（PET）的特性致使BODIPY發生熒光淬滅。只有當特定蛋白的巰基與馬來酰亞胺發生加成反應后，BODIPY的熒光才能恢復（圖1）。作者還將該分子應用于細胞裂解液和哺乳動物中特定蛋白的熒光標記。相關成果以“A green BODIPY-based, super-fluorogenic, protein-specific labelling agent”為題發表在Angew. Chem. Int. Ed.上（DOI: 10.1002/anie.201805482）。

作者選擇了麥芽糖結合蛋白（MBP）作為測試蛋白，并將可遺傳編碼的肽標簽dC10α標記在C末端得到MBP-dC10α。接著，作者對MBP-dC10α與YC23的反應進行了研究，結果表明：在與測試蛋白反應之前， YC23顯示出可忽略的背景熒光（圖2，x軸上的黑線）。隨著MBP-dC10α加入量的增加，YC23的熒光強度**增加（圖2）。

隨后，作者對25 μM MBP-dC10α與25 μM YC23反應的動力學進行評估，探究其兩次加成反應所擬合的函數模型，結果發現，其主要與二階模型相匹配，速率常數為868±118 M^-1min^-1（圖3）。

圖3. 定量YC23與定量MBP-dC10α反應后的熒光強度隨時間變化的擬合圖

接下來，為了探究MBP-dC10α與YC23結合的選擇性，作者在細菌裂解液中用YC23標記MBP-dC10α，并將溫度升至95 ℃且維持15 min，再進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析。結果顯示，被標記的測試蛋白始終保持其明亮的熒光，甚至在變性條件下也能如此（圖4B）。在細胞裂解液的復雜生物混合物中，低至10 μM的YC23足以可視地標記測試蛋白。圖4A與4B的比較結果揭示了YC23標記的選擇性，只有目標蛋白被明確標記并發出強烈的熒光。

圖4. MBP-dC10α與YC23結合的選擇性分析

在細菌裂解液中探究了YC23的選擇性后，作者又研究了其在哺乳動物細胞中的相關特性。作者選擇了只存在于細胞核中的組蛋白H2B為特定蛋白，并將dC10α標記在它的C末端，隨后，用能表達相關蛋白的質粒轉染Hela細胞，將YC23與Hela細胞共同孵育。結果發現，YC23的熒光只存在于細胞核中，證明了其在哺乳動物細胞中具有較好的選擇性（圖5）。

圖5. Hela細胞的蛋白標記成像

總結：作者開發了一種用于蛋白標記的新型雙馬來酰亞胺BODIPY熒光探針，在細菌裂解液和哺乳動物細胞中均能標記特定的蛋白，且具有較高的選擇性和穩定性，這對于探究蛋白的表達、定位和轉運具有重要的應用價值。