喹啉類化合物二肽基肽酶-4(DPP-4)的**作用

摘要：本文以聯苯化合物A7 為先導化合物設計并合成了10 個未見文獻報道的2-(2,4- 二氯苯基) -3- 氨甲基-4- 取代-6- 取代喹啉衍生物(B1 - B10)，并測定其對DPP-4 的**率和IC50 值。目標化合物通過引入的氮原子和芳香環可增強與酶Arg 125 和Tyr 547 殘基的作用。

具有DPP-4 **活性的新型氨甲基聯苯衍生物[4]，其中，代表化合物A7( 圖2) 表現出較好的活性和一定的選擇性：對DPP-4、DPP-7 和DPP-8 的**活性( IC50值) 分別為0.082、2.750 和0.560 μmol/L。化合物A7 與DPP-4 酶的結合模式顯示( 圖3，綠色)，2,4- 二氯苯基與母環成垂直構象占據S1 口袋，與其中的酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp) 和纈氨酸(Val)的氨基酸殘基發生疏水作用；氨基可與谷氨酸(Glu)205/206 和Tyr 662 形成鹽橋或氫鍵作用；三唑環伸向S2 口袋與苯丙氨酸(Phe)357 發生π-π 疊加作用。

根據DPP-4 酶腔體特點，S1 和S2 口袋之間有一個體積較大的空腔，可容納多環母核結構( 圖3)。為進一步增強DPP-4 的**活性，本文對化合物A7 進行如下結構改造：①保留2,4- 二氯苯基和氨甲基；②在苯環上引入N 原子以增強其與精氨酸(Arg)125 的作用，同時駢合一個苯環形成喹啉環，增強其與Tyr 547 的π-π 疊加作用；③母環上引入給電子基團( 甲氧基或甲基)，電子云密度增加有利于π-π 疊加作用；④ S2 口袋結合基團為芳香環，并通過雜原子與喹啉母環相連。

化合物A7 以及本研究設計的喹啉衍生物和DPP-4 酶結合模式顯示A7 母環與喹啉母環幾乎平行，2,4- 二氯苯基、氨基與酶的結合模式基本一致，并且喹啉環較化合物A7 擁有更多位置可進行結構修飾，易于引入與DPP-4 酶其他氨基酸殘基結合的官能團。

根據上述設計思想，本研究設計合成10 個未見報道的B 類喹啉衍生物(B1 ～ B10)，這些新化合物的結構特征如下：①喹啉2- 位為2,4- 二氯苯基；② 3- 位為氨甲基；③ 4- 位為S2 口袋結合基團——芳香環或芳雜環，并通過雜原子(N、O 或S 原子)與喹啉母環相連；④ 6- 位為給電基團甲氧基或甲基。B 類化合物結構通式如圖4 所示。為驗證所設計化合物的合理性，合成B11 ～ B13 3 個已知喹啉化合物[5]，與化合物B1 ～ B10 進行比較。

B 類化合物是一種多取代喹啉化合物，其合成的關鍵是喹啉3- 位氨甲基和4- 位R2 基團的引入。本研究以2,4- 二氯苯甲酰氯(12) 為起始原料，設計以下合成路線( 圖5)。化合物12 與丙二酸二乙酯發生縮合反應得2-(2,4- 二氯苯甲酰基) 丙二酸二乙酯(13) [6—7]，經三氯氧磷氯化得2-[ 氯(2,4-二氯苯基) 亞甲基] 丙二酸二乙酯(14)，與苯胺化合物經取代反應得中間體15a 和15b[8]。然后經高溫環合制得2-(2,4- 二氯苯基)-4- 羥基-6- 取代喹啉-3- 羧酸乙酯(16a 和16b)，再經氯代亞砜氯代得關鍵中間體2-(2,4- 二氯苯基) -4- 氯-6- 取代喹啉-3- 羧酸乙酯(17a 和17b)，然后與親核試劑(1,2,4- 三唑、苯硫酚、4- 氟苯硫酚、3- 甲氧基苯硫酚或苯酚) 發生親核取代反應得2-(2,4- 二氯苯基) -4- 取代-6- 取代喹啉-3- 羧酸乙酯(18a ～18j)，再經酯基還原得2-(2,4- 二氯苯基) -3- 羥甲基-4- 取代-6- 取代喹啉(19a ～ 19j)。19a ～ 19j

可與鄰苯二甲酰亞胺發生Mitsunobu 反應得2-(2,4-二氯苯基) -3- 鄰苯二甲酰亞胺甲基-4- 取代-6- 取代喹啉(20a ～ 20j) ；也可先與三溴化磷發生溴代

反應，再與鄰苯二甲酰亞胺發生Gabriel 反應得縮合產物20a ～ 20j[9—10]。較后20a ～ 20j 經氨解制得目標化合物2-(2,4- 二氯苯基) -3- 氨甲基-4- 取代-6- 取代喹啉(B1 ～ B10)，B11 ～ B13 的合成方法與B1 ～ B10 相似。

本研究對目標化合物的體外DPP-4 **活性和選擇性進行了初步研究。DPP-4 酶活測定是利用甘氨酰脯氨酸對硝基苯胺(Gly-Pro-p-nitroanilide) 為底物的發色法，以此評價化合物的活性[11—12]。

本研究采用DPP-4 Drug Discovery Kit 試劑盒(Enzo Life Sciences 公司) 對化合物B1 ～ B13 進行體外活性篩選。將B1 ～ B13 用DMSO 溶解，配制

成濃度為10 μg/ml 的待測液。B1 ～ B10(10 μg/ml)初篩**率測定結果均大于50 ％， 而化合物B11 ～ B13(10 μg/ml) 的**率均小于50％，進一步證明目標化合物與酶結合模式的正確性。

再測定初篩**率測定結果大于50％的化合物(B1 ～ B10) 的IC50 值。其中陰性對照、陽性對照西格列汀和被測樣品均含DPP-4 酶(17.3 U/L)15 μl，陽性對照、陽性空白對照、被測樣品和被測樣品空白對照均加入目標化合物待測液10 μl，再用50 mmol/L 的Tris-HCl 緩沖液將DPP-4 酶和被測樣品稀釋至50 μl，然后于37 ℃保溫10 min。測其在405 nm 處的吸收值，然后加入0.2 mmol/L 的甘氨酰脯氨酸對硝基苯胺50 μl 反應1 h，每隔5 min 測一次OD 值。B1 ～ B10 每個樣品測6 個點( 濃度依次為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 和4.0 μg/ml)，每個點取3 個平行，較終結果取其平均值，并用軟件(ICp) 處理并計算其IC50 值( 表1)。

結果顯示，除化合物B1 和B6，其余化合物均表現出較好的DPP-4 **活性，與陽性對照西格列汀(IC50=0.035 μmol/L) 相當。

由于S2 口袋為疏水口袋，選取疏水性較強的苯巰基化合物B2 和B3 進行DPP-4 及其同工酶DPP-7 和DPP-8 酶選擇性的初步探究，實驗方法同上。結果顯示B2 和B3 的選擇性不及A7 和陽性對照藥西格列汀( 表2)。

根據上述活性測試結果可得出以下初步構效關系：

(1) 化合物B1 ～ B10(10 μg/ml) **率均大于50％，其中化合物B5 對DPP-4 的IC50 與A7 相當，提示引入喹啉環，可保持**活性；

(2) 喹啉4- 位苯氧基取代活性優于苯巰基( 如：B5 優于B2、B3 和B4 ；B10 優于B7、B8 和B9)，可能是由于氧原子半徑小于硫原子，苯氧基較苯巰基更適合伸入S2 口袋；

(3)1,2,4- 三唑與喹啉母環直接相連，DPP-4 **活性明顯降低( 如B1 和B6)，提示分子剛性增強，三唑基不能進入S2 口袋；

(4) 甲氧基給電能力優于甲基，喹啉6- 位為甲氧基取代時，喹啉環的電子云密度升高，有利于增強喹啉母環與Tyr 547 殘基形成的π-π 疊加作用( 如B1 ～ B5 分別優于B6 ～ B10)。

上述實驗結果顯示，化合物B2 ～ B5 和B7 ～B10 均表現出較好的DPP-4 **活性，與陽性對照藥西格列汀相當，但同工酶選擇性初步探究顯示，該類化合物對DPP-7 和DPP-8 酶的選擇性不及陽性對照藥。下階段將通過進一步結構修飾提高化合物的選擇性以進行深入研究。

喹啉化合物產品列表：

喹啉類

5-氨基喹啉580-15-4

5-甲基喹啉491-35-0

異喹啉119-65-3

喹啉-d7

8-氨基喹啉578-66-5

4-喹啉醇611-36-9

6-甲基喹啉91-62-3

4-喹啉甲醛4363-93-3

5-氨基喹啉611-34-7

8-甲基喹啉611-32-5

5-喹啉醇578-67-6

8-喹啉硼酸86-58-8

2,4-喹啉二醇86-95-3

2,8-喹啉二醇15450-76-7

8-羥基喹啉148-24-3

6-羥基喹啉580-16-5

喹啉黃8003-22-3

3-氨基喹啉580-17-6

2-羥基喹啉59-31-4

2,2′-聯喹啉119-91-5

喹啉黃8004-92-0

2-氨基喹啉580-22-3

2-溴喹啉2005-43-8

2-苯基喹啉612-96-4

3-溴喹啉5332-24-1

3-甲基喹啉612-58-8

3-喹啉甲醛13669-42-6

4-溴喹啉3964-04-3

5-硝基喹啉607-34-1

6-氯喹啉612-57-7

6-硝基喹啉613-50-3

6-溴喹啉5332-25-2

8-硝基喹啉607-35-2

8-溴喹啉16567-18-3

2-喹啉甲醛5470-96-2

喹啉-3-羧酸6480-68-8

喹啉-4-羧酸486-74-8

5-溴喹啉4964-71-0

8-喹啉甲酸86-59-9

2-氯喹啉612-62-4

4-氯喹啉611-35-8

7-甲基喹啉612-60-2

喹唑啉253-82-7

3-喹啉硼酸191162-39-7

1,2,3,4-四氫喹啉635-46-1

全氫異喹啉6329-61-9

喹喔啉N-氧化物6935-29-1

3-羥基異喹啉7651-81-2

上述產品齊岳生物均可供應，僅用于科研！

小編：wyf 07.06