選擇色譜填料的時候,一般不會選錯填料的鍵合相(Bonded Phase)種類,但往往會選錯孔相關的參數,尤其是孔徑。一般色譜填料的孔徑是根據目標物的分子大小、分子尺寸、水化半徑等性質來選擇的,類似于膜過濾中膜孔大小的選擇;
一般小分子化合物(<1KDa,氨基酸,單糖等)選擇60?的孔,大一點的多肽分子(<3KDa,比伐盧定等)選擇100到120?孔,更大的多肽(>5KDa,胰島素等)需要選擇200?或以上的孔,更大分子量的蛋白或抗體的純化需要選擇2000A甚至更大的孔。
孔選擇結果的好與壞
一般色譜填料的制造過程會盡量避免過多的小孔,即孔徑分布的高斯曲線(Gaussian Curve)中左邊遠離平均孔徑的那一部分,因為這一部分孔是容易形成對目標物空間位阻(Steric Hindrance)的。
孔在色譜過程中重要的表現在于影響目標物的傳質作用(Mass Transfer),理想的孔徑大小是大到能讓目標物隨流動相自由遷移而不受到空間位阻作用,孔與孔之間全部通透,過小的孔和死胡同似的孔都會造成目標物在色譜過程中的傳質變差、增加譜帶展寬(Band Broadening),相鄰兩個峰靠得更近或交叉部分變大,從而影響分析效果或制備時收率(Recovery Yield)降低;更極端時過小的孔徑選擇會造成死吸附,洗脫時產品收率大幅降低,只有在再生(Regeneration)時才有可能被強洗脫能力流動相洗脫或者堿破壞。
更大的平均孔徑可以降低小孔對目標物的空間位阻,提高傳質作用效率,分離效果變好;但是物極必反,也不是孔選的越大越好。但是更大的孔在孔容一定的情況下會降低填料的比表面積,有時會導致純化載量(Capacity)的降低。所以孔徑的選擇,不在大,合適就好。
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