Ab-PROTAC偶聯物是將PROTAC選擇性遞送至特定細胞的一種方法。抗體-**偶聯物（ADC）可以將毒素特異性地傳遞給**細胞，大程度減少毒副作用。ADC還可以增強曲妥珠單抗（Herceptin）或培妥珠單抗（Perjeta）等單克隆抗體的，然而由于ADC固有的局限性（例如被非靶向細胞攝取），**只有少數ADC獲得FDA批準。ADC發展面臨的主要挑戰與劑量限制性毒性（DLT）有關，即功效與脫靶毒性之間難以平衡。ADC的另一個缺點是實際傳遞到中的**劑量很少，這意味著**分子必須具有**的細胞毒性，這可能會導致毒副作用。由于PROTAC具有催化性進而較低劑量便可降解目標蛋白，因此PROTAC可能是ADC的理想負載。

采用曲妥珠單抗-PROTAC偶聯物可以實現PROTAC的組織選擇性遞送，并在HER2陽性細胞中選擇性降解目標蛋白。偶聯物將特異性結合HER2/neu受體，通過內吞進入細胞后被溶酶體分解釋放出活性PROTAC（見圖1A）。鑒于BRD4是炎癥和**癥的潛在靶標，探索了****細胞模型中利用曲妥珠單抗和PROTAC偶聯物實現特異性細胞類型中BRD4降解的潛力。

本文**選擇BRD4降解劑MZ1的類似物PROTAC 1進行概念驗證研究（圖1B）。據報道100 nM MZ1處理細胞4小時后便可實現BRD4的完全降解，這種類型的PROTAC由BET的配體JQ1和VHL的配體組成。

**制訂了通過疊氮和炔的環加成反應將PROTAC和曲妥珠單抗偶聯的策略。利用化合物1的VHL配體部分上的游離羥基來結合疊氮端的PEG生成疊氮功能化的PROTAC，該羥基對于VHL的結合不可或缺，因此結合將PROTAC活性直到被溶酶體水解后才能生成活性的PROTAC。之后還原曲妥珠單抗的二硫鍵并與化合物13反應生成炔基功能化的曲妥珠單抗并將反應物在pH 8.5緩沖液中孵育過夜使其水解為具有血清穩定性的馬來酰胺酸，后通過炔基官能化的曲妥珠單抗和疊氮-PROTAC 2之間的反應獲得具有可控載荷和具有血清穩定性的Ab-PROTAC 3偶聯物，從而確保了偶聯物僅可通過酯基的水解釋放PROTAC。Ab-PROTAC 3偶聯物的合成由于沒有采用銅（I）催化而排除了銅（I）的副作用。LC-MS分析顯示了偶聯物的成功合成，ELISA證實了抗體結合后活性仍完全保留。此外作者還是發現Ab-PROTAC 3具有穩定性：在37攝氏度pH 7.4的PBS中孵育4小時后仍有98.8％均保持完整結構，在孵育24小時后結構完整的偶聯物仍高達83.5％（見圖1E）。

基于細胞系中HER2/neu受體和BRD4的表達水平（見圖2A、2B）和在測試相同條件下細胞系中游離PROTAC 1降解BRD4的能力（圖2C），研究者選擇了兩種HER2陰性****細胞系（MCF-7和MDA-MB-231）和兩種HER2陽性****細胞系（SK-BR-3和BT-474）來檢測Ab-PROTAC 3的生物學活性。HER2 +和HER2-表型中，PROTAC 1對BRD4的降解差異性可能與細胞系中BRD4的表達差異有關。每種細胞系均用PBS、抗體（曲妥珠單抗）或陽性對照4（圖2E）或不同濃度的Ab-PROTAC 3處理，并將BRD4降解劑4對BRD4的降解量作為陽性對照。認識到Ab-PROTAC 3在生理pH下穩定，作者在無血清培養基中用Ab-PROTAC 3處理細胞4小時或在處理1小時后將偶聯物除去再培養23小時。

WB分析（圖2D）表明Ab-PROTAC 3僅選擇性降解HER2+細胞中的BRD4，而對HER2-細胞中的BRD4無影響。用100 nM Ab-PROTAC 3處理細胞4 h，僅在HER2+細胞系中觀察到了BRD4的完全降解（50 nM也能觀察到BRD4顯著降解），而在任何測試濃度下HER2-細胞系均未觀察到降解。此外，用Ab-PROTAC 3處理HER2+細胞1小時后除去Ab-PROTAC 3繼續孵育23小時也觀察到了BRD4的顯著降解，這表明偶聯物在1小時的期內已充分進入到HER2+細胞中并被溶酶體分解產生了劑量的PROTAC 1。由于Ab-PROTAC 3對缺少HER2/neu受體表面的細胞不能進行HER2/neu介導的內化，因此沒有觀察到降解。應該注意，在用曲妥珠單抗處理細胞的任何實驗中均未觀察到BRD4降解。這些實驗結果證明了HER2/neu介導的抗體-PROTAC偶聯物能選擇性傳遞PROTAC。

接下來，進一步探究Ab-PROTAC 3是否通過蛋白酶體誘導BRD4降解，在使用/不使用蛋白酶體劑硼替佐米（BTZ）的情況下，將細胞與PBS、陽性對照4或100 nM Ab-PROTAC 3孵育后將細胞裂解，WB顯示了蛋白酶體劑可阻止兩種HER2+細胞系中Ab-PROTAC 3介導的BRD4降解（圖2F）。

受體介導的抗體內化已通過不同方法進行了廣泛研究，包括放射標記、熒光顯微鏡、流式細胞術或細胞毒性測定。其中，使用熒光標記抗體的共聚焦顯微鏡可以對抗體在不同細胞區室（例如內體或溶酶體）進行定位。先前有研究報道使用這種方法確定曲妥珠單抗的內化和細胞內區室化，證明HER2/曲妥珠單抗復合物的內體內化。考慮到這些先例，作者旨在通過共聚焦顯微鏡研究活細胞中Ab-PROTAC 3的運輸，以確認內化并進一步分析結合物在細胞內環境中的情況。對于這些研究，使用了熒光標記的AlexaFluor488-Ab-PROTAC（AF488-3），將HER2 + SK-BR-3細胞與100 nM AF488-3孵育1小時后洗滌細胞，并在1、4、8和24小時的時間成像以研究復合物的運輸（見圖3A）。1 h時在細胞表面觀察到AF488-3，而在孵育4 h后AF488-3已經部分進入到不同的細胞室內，大概是初級和次級內體（圖3A和3C）。8小時后AF488標記的區室與溶酶體廣泛共定位（圖3A和3C）；在沒有將結合物洗脫的情況下也觀察到了相似的結果。溶酶體消化Ab-PROTAC 3后須釋放游離的活性PROTAC 1，然后進入細胞核以才能觸發BRD4降解。在相同條件下表達**水平的HER2受體的MCF-7細胞無法攝取AF488-3（圖3B），這與這些細胞的BED4不能被Ab-PROTAC誘導降解一致。

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