抗氧化活性是中藥的重要藥效之一，化學(xué)發(fā)光法（CL）是有力的評(píng)價(jià)手段，具有靈敏度高、線性范圍寬、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。化學(xué)發(fā)光(Chemiluminescence, CL)反應(yīng)是指反應(yīng)體系中的物質(zhì)吸收了反應(yīng)釋放的化學(xué)能, 電子從基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài), 再以光輻射的形式釋放能量回到基態(tài)的過程。化學(xué)發(fā)光分析法是通過分析化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中輻射光強(qiáng)度大小來確定反應(yīng)體系中某種物質(zhì)濃度的方法。目前, 常用于中藥抗氧化成分的分析方法除化學(xué)發(fā)光法外, 還有二苯代苦味肼基自由基(1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)法、氧化自由基吸收能力(Oxygen Radical Absorbance Capacity, ORAC)法和鐵離子還原/抗氧化能力(Ferric Reducing Antioxidant Power, FRAP)法等。它們都是利用待測(cè)物與某類自由基反應(yīng), 通過測(cè)定反應(yīng)后剩余的自由基或產(chǎn)物來評(píng)價(jià)待測(cè)物的抗氧化性。DPPH法、ORAC法和FRAP法通過紫外-可見分光光度計(jì)或熒光分光光度計(jì)直接測(cè)定DPPH、熒光素鈉和Fe2+-三吡啶三嗪發(fā)光, 操作快速簡(jiǎn)便, 但是, 具有較強(qiáng)的光吸收特性或熒光(淬滅)特性的物質(zhì)會(huì)干擾測(cè)定結(jié)果。化學(xué)發(fā)光法不需要外界提供能量, 可避免背景光和雜散光的干擾, 具有靈敏度高、線性范圍寬、無光散射的干擾、重現(xiàn)性好、儀器簡(jiǎn)單和分析速度快等優(yōu)點(diǎn)。

化學(xué)發(fā)光法在中藥抗氧化活性測(cè)定的方法

1.簡(jiǎn)單化學(xué)發(fā)光反應(yīng)測(cè)定中藥抗氧化活性

簡(jiǎn)單的化學(xué)發(fā)光法應(yīng)用是將發(fā)光試劑和待測(cè)物直接混合進(jìn)行化學(xué)反應(yīng), 通過記錄發(fā)光強(qiáng)度的變化值, 評(píng)價(jià)待測(cè)物的抗氧化活性。中藥的抗氧化作用一般表現(xiàn)為對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的**能力, 檢測(cè)到的化學(xué)發(fā)光信號(hào)越弱, 表明待測(cè)樣品的抗氧化能力越強(qiáng), 通常以清除率或半**濃度(Half Maximal Inhibitory Concentration, IC50)來表征。清除率(%)=[(陰性對(duì)照光強(qiáng)-樣品光強(qiáng))/(陰性對(duì)照光強(qiáng)-空白背景值)]×**。以待測(cè)樣品的濃度為橫坐標(biāo), 相應(yīng)清除率為縱坐標(biāo), 繪制濃度-清除率曲線圖, 當(dāng)清除率為50%時(shí)樣品的濃度為IC50。

采用鄰苯三酚-魯米諾體系測(cè)定紅景天苷及其苷元酪醇O2-·的清除率。試管中先后加入碳酸鹽緩沖液(Carbonate Buffer Solution, CBS)(0.1 Mm, pH 10.3)300 μL, 魯米諾溶液(1.0 Mm)100 μL, 樣品溶液50 μL, 鄰苯三酚溶液(1 mmol·L-1)50 μL, 振蕩6 s后測(cè)得酪醇清除率略高于紅景天苷, 說明紅景天苷的抗氧化活性與苷元有關(guān)。舒希凱[6]分別采用鄰苯三酚-魯米諾、過氧化氫-魯米諾、Fe2+-過氧化氫-魯米諾體系考察了3種干燥方法處理的芍藥花50%醇提物對(duì)O2-·、H2O2、OH·的清除率。以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照, 依次加入魯米諾溶液4 mL、樣品0.5 mL、氧化溶液0.2~0.4 mL, 光電倍增管高壓800 V, 記錄200~400 s內(nèi)的發(fā)光積分強(qiáng)度, 計(jì)算IC50。結(jié)果IC50陰干 < 烘干 < 凍干, 與總酚和總黃酮含量呈正相關(guān)。Benchennouf A等[7]采用Co2+-過氧化氫-魯米諾體系測(cè)定枸杞不同部位(樣品經(jīng)正己烷脫脂, 二氯甲烷和甲醇提取, 提取液經(jīng)液液萃取分為甲醇、乙酸乙酯和正丁醇部位) OH·的清除率。樣品池中加入含有CoCl2(2 mg·mL-1)和EDTA (10 mg·mL-1)的魯米諾溶液(0.56 mM)100 μL, 硼酸緩沖液控制pH 9, 加入提取物溶液, 混合15 s, 再加入H2O2(5.4 mM)25 μL開始反應(yīng)。結(jié)果顯示乙酸乙酯部位的抗氧化活性強(qiáng)。Lee J C等[8]采用過氧化氫-魯米諾體系揭示了雪蓮醇提物的抗氧化活性。魯米諾溶液(磷酸鹽緩沖液調(diào)pH值至7.4) 0.1 mL和樣品溶液0.2 mL混合120 s后加入H2O2溶液0.1 mL, 記錄300 s內(nèi)的累積發(fā)光強(qiáng)度。雷利芳[9]使用微孔板式生物化學(xué)發(fā)光儀測(cè)定覆盆子水提物對(duì)3種自由基的清除能力。將樣品稀釋后加于微孔中, 再將氧化劑和魯米諾分別引入分析系統(tǒng), 振板混勻使之快速反應(yīng), 記錄發(fā)光信號(hào)。對(duì)3種體系的條件進(jìn)行優(yōu)化, 當(dāng)pH值為9.2, 魯米諾、H2O2濃度分別為4×10-5 mol·L-1和0.48%時(shí), 清除H2O2能力較強(qiáng); 魯米諾、鄰苯三酚、NaOH濃度分別為1×10-4、2.5×10-4、6.0×10-3 mol·L-1時(shí), 清除O2-·的能力強(qiáng); 魯米諾、CuSO4、H2O2濃度分別為5×10-6 mol·L-1、7×10-8 mol·L-1、0.24%時(shí), 清除OH·的能力強(qiáng)。結(jié)果顯示覆盆子水提物對(duì)這3種自由基均有明顯的**作用。

2.流動(dòng)/順序注射化學(xué)發(fā)光分析法測(cè)定中藥抗氧化活性

大多數(shù)化學(xué)發(fā)光非常微弱, 且反應(yīng)速度很快, 手工操作重現(xiàn)性差, 采用流動(dòng)注射(FI)進(jìn)樣可提高測(cè)定的重現(xiàn)性, 不需要達(dá)到化學(xué)平衡的狀態(tài)下就能進(jìn)行操作, 實(shí)現(xiàn)自動(dòng)連續(xù)分析。在流動(dòng)注射分析(Flow Injection Analysis, FIA)的基礎(chǔ)上, 又發(fā)展了順序注射(Sequential Injection, SI), 多通道選擇閥分別與檢測(cè)器、樣品、試劑等通道相連, 試劑與試樣由于徑向擴(kuò)散和軸向?qū)α髯饔没旌弦欢〞r(shí)間后推至檢測(cè)器。與傳統(tǒng)的流動(dòng)注射分析相比, 順序注射可以用同一裝置完成不同項(xiàng)目的分析而無需改變流路設(shè)置

3.**液相色譜化學(xué)發(fā)光聯(lián)用法(HPLC-CL)測(cè)定中藥抗氧化活性

中藥為多組分復(fù)雜體, 傳統(tǒng)方法對(duì)化學(xué)成分逐一分離、鑒定并評(píng)價(jià)抗氧化性, 步驟繁瑣、費(fèi)時(shí)。將化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器與HPLC等技術(shù)聯(lián)用, 樣品經(jīng)分離后進(jìn)入T型管與氧化劑和發(fā)光劑反應(yīng), 記錄發(fā)光信號(hào), 可以將**分離手段與高靈敏的檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合, 使復(fù)雜組分經(jīng)過色譜柱逐一分離, 進(jìn)行抗氧化活性的測(cè)定和評(píng)價(jià)。在此基礎(chǔ)上, 再輔以液質(zhì)(HPLC-MS)鑒定, 可進(jìn)一步明確抗氧化成分的結(jié)構(gòu)。

4.毛細(xì)管電泳化學(xué)發(fā)光聯(lián)用法(CE-CL)測(cè)定中藥抗氧化活性

毛細(xì)管電泳是一類以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的液相分離技術(shù), 將其與化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器聯(lián)用, 具有分析速度快、試劑用量少、儀器簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。將分離毛細(xì)管末端插入內(nèi)徑稍大的反應(yīng)毛細(xì)管中, 另在反應(yīng)毛細(xì)管上鉆一小孔插入引流毛細(xì)管, 發(fā)光試劑采用重力引流方式通過引流管引入, 分析物、發(fā)光試劑在分離毛細(xì)管出口處相遇, 進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。但是, 由于受到電泳液流與發(fā)光液流相互干擾、信噪比不高等影響; 目前, CE-CL聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用較少。

采用次氯酸鈉-過氧化氫-魯米諾和Cu2+-過氧化氫-魯米諾體系研究麻黃、苦參、黃連、黃柏和貝母中生物堿的抗氧化活性。CE緩沖介質(zhì)為硼酸鹽, pH 9.60, 分離電壓15 kV。魯米諾的濃度3.0 mmol·L-1, H2O2濃度15 mmol·L-1, NaClO濃度0.05 mmol·L-1, 引流位差25 cm; 魯米諾濃度2.5 mmol·L-1, H2O2濃度10 mmol·L-1, Cu2+濃度0.5 mmol·L-1, 引流位差5 cm。結(jié)果顯示苦參含有的抗氧化組分較多且氧化活性也較強(qiáng), 其余依次是黃柏、麻黃、黃連和貝母。還建立了黃芪抗氧化活性生物指紋圖譜。測(cè)得黃芪甲苷等6個(gè)色譜峰對(duì)OH·具有清除作用。

化學(xué)發(fā)光法應(yīng)用于中藥分析, 具有靈敏度高、線性范圍寬、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。可以直接測(cè)定樣品對(duì)各種氧自由基的清除率, 引入流動(dòng)/順序注射裝置可實(shí)現(xiàn)高通量篩選, 與HPLC或CE等分離方法聯(lián)用, 可同時(shí)對(duì)多個(gè)化學(xué)成分的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià), 建立生物活性譜, 探索譜效關(guān)系, 結(jié)合HPLC-MS技術(shù), 還可對(duì)抗氧化成分的結(jié)構(gòu)加以確證。

相關(guān)產(chǎn)品

魯米諾/3-氨基苯二甲酰肼/發(fā)光氨

異魯米諾/4-氨基鄰苯二甲酰肼

吖啶酯DMAE-NHS

吖啶酰肼NSP-SA-ADH

吖啶酯ME-DMAE-NHS

TOOS/N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽

MAOS/N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺鈉鹽

ADOS/N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基l)-3-甲氧基苯胺鈉鹽

TOPS /N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽

ADPS/N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺鈉鹽

ALPS/N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺鈉鹽

DAOS/N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺鈉鹽

HDAOS/N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺鈉鹽

MADB/N,N-二(4-磺丁基)-3,5-二甲基苯胺鈉鹽

三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸鹽Tris-HCL

三（羥甲基）氨基甲烷Tris

N,N-二羥乙基甘氨酸BICINE

3-(環(huán)己胺)-1-丙磺酸CAPS

3-嗎啉丙磺酸MOPS

N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸TAPS

N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-3-丙磺酸 EPPS

3-(N-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸MOPSO

4-羥乙基哌嗪乙磺酸HEPES

哌嗪-N,N'-二(2-乙磺酸)PIPES

磷酸烯醇丙酮酸三(環(huán)已胺)鹽PEP

病毒保存液

肝素鋰

乙二胺四乙酸二鉀/EDTA二鉀

血清分離膠/血液分離膠

肝素抗凝劑

乙二胺四乙酸三鉀/EDTA三鉀

血液促凝劑

**促凝粉

**硅化劑

水溶性硅化劑

草酸鉀

鈣離子螫合抗凝劑

弱效抗凝劑

以上內(nèi)容來自zzj 2021.2.23