用酶標記各種特異性配體(抗體、抗原等),利用酶的催化放大作用和特異性作用而建立的標記免疫分析叫做酶免疫分析( enzyme immunoassay，EIA) "。在酶免疫分析中將在酶催化作用下產生新化合物的物質統稱為底物。一種酶能催化特定的底物,將其轉化為有可檢測信號的產物。酶僅使底物轉化為產物,本身在反應過程中并不消耗,反復起催化作用,將信號放大。傳統的EIA 采用色原底物測量可見光的吸光度,隨著酶免疫分析技術的發展,出現了靈敏度更高的放射性底物、熒光底物和化學發光底物,而改為測量釋放的射線、熒光和化學發光。由于采用放射性底物存在接觸和處理放射性物質的危險,而隨后出現的熒光和化學發光檢測的靈敏度已經達到或超過該方法,因此放射性底物出現后不久即很少使用。目前常用于EIA 的酶包括如下3種:辣根過氧化物酶( horseradish peroxidase , HRP)、堿性磷酸酶( alka-line phosphatase ,AP)及β-D-半乳糖苷酶( B-D-galactosidase,CAL)。其中 HRP分子小,易于與蛋白耦聯,而且呈色性好,應用廣泛,因此對HRP底物的研究在基于酶的分析檢測中具有非常重要的意義。本文對近年來HRP底物的研究進展作一綜述。

色原底物

早期HRP底物是色原,常規的色原底物在酶作用下產生一種新的顏色(或者吸收光譜發生改變),這種檢測方法的優點在于產生的顏色很容易用肉眼或光譜儀器檢測,檢測儀器的價格一般也比其他檢測方法所用的儀器便宜;缺點是檢測靈敏度普遍低于其他酶檢測方法。

色原底物的基本結構可用變化多樣的芳香族胺和酚表示,大多數芳香胺,酚和它們的混合物在酶促氧化時會產生有色的縮聚物。常見的芳胺類色原底物包括:鄰苯二胺( OPD),四甲基聯苯胺(TMB)、2,2'-連氮-雙-(3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、5-氨基水楊酸(5-AS),鄰聯二茴香胺( ODA),鄰聯甲苯胺(OT)等1。部分色原底物的分子結構式見圖1。

圖1部分色原底物的分子結構式

3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)和3,6-二氨基-9-乙基咔唑常用于過氧化物酶的活性染色。Krieg 等'將AEC連接鰲合的N-芐基部分,得到-類新型的N-芳基甲基-苯胺色原底物(通用結構式見圖2)。其制備方法是將AEC或3,6-二氨基-9-乙基咔唑與芳香醛混合濃縮,隨后將濃縮產物Schiff堿用NaBH,還原即可。與傳統的芳胺類色原底物相比,這種新型底物的靈敏度和適用性等得到很大改進。

圖2 3-(N-芳基甲基)氮基9-乙基咔唑(X=OH，NHR)

結論

HRP在酶免疫分析中占有重要地位。在前述的三類主要HRP底物中,早期的色原底物檢測靈敏度不高,隨后發展起來的熒光底物和化學發光底物**提高了靈敏度,但面臨的共同問題是檢測儀器價格昂貴,從而限制了其應用。另外這兩種底物自身也都存在一些缺陷:熒光信號易飽和,易猝滅,以及自發熒光對實驗結果產生干擾;化學發光必須隨時采集,光積分時間長等。與之相比,納米金底物具有-一系列突出優點:靈敏度高,納米金顆粒的消光系數比色原底物和熒光基團高大約1000倍;檢測成本低,采用電鏡甚至目視即可檢測;沉積金屬非常穩定,使檢測信號容易得到恒定值,等等。納米金底物已經作為新型的標記探針,用于免疫組化中稀有組織抗原的高靈敏度檢測。

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