西安齊岳生物提供辣根過氧化物酶(HRP)標記前列腺素E2、前列腺素A2、氯磺隆、膽固醇、地塞米松、雌二醇、孕酮、生育酚、維生素B6、維生素A、膽鈣化醇、麥角鈣化甾醇、煙酸、黃素單核苷酸、核黃素、石杉堿甲、新橙皮苷二氫查爾酮、重樓皂苷、松香酸、香草酸、漢黃芩苷、辣椒堿、辣椒素、膽紅素、蘆丁、齊墩果酸等小分子**。

1、

1.1 lgG

1.1.1  雞IgG重鏈抗血清的制備將經離子交換層析提純的雞lgG進行SDSPA GE。電泳后切割重鏈部分凝膠條，經無菌處理加入等體積的弗氏佐劑乳化﹐常規方法免疫制備抗血潛。1.3.2兔抗雞gG抗血清的制備過離子交換層析后又經分子篩層析提純的雞IgG同樣按常規方法免疫家兔，制備免抗雞IgG抗血清。

1.1.2  兔抗雞lG的提純方法如雞IgG的提純。分別進行辛酸-50 %SAS 35 %SAS鹽析以及過DEAE纖維素(DE52)離子交換層析柱提純兔抗雞IgG。經SDSPA GE檢測比較2種方法提純物的純度。

將雞抗Yucaipa病毒陽性血清作從2-7至212的倍比稀釋，通過在 Dot-ELISA中的顯色效果判定自制酶標抗體的質量。1.62

1.2  Yucaipa雞胚尿囊毒從2‘倍比稀釋至2-16，正常SPF 雞胚混合尿囊液從2'倍比稀釋至2-7。Dot-ELISA方法測試雞IgG重鏈免疫與雞IgG全分子免疫產生并制備的兔抗雞IgGHRP酶標抗體(前者**工作濃度為1/200，后者為1/ 1 000)在檢測Yucaipa雞胚尿囊液毒時的非特異性反應情況。

2、

2.1 IgG

  由圖Ⅰ可以看出，經SDSPAGE檢測發現其中仍含有較多的雜蛋白未能去除,而再經33%或35%SAS處理僅能去除其中的部分雜蛋白。

  （圖1）

注: 1．辛酸-50 %SAS-35 %SAS提純雞lgG;

2．蛋白質分子量標準;

3．辛酸-50 %SAS提純雞IgG;

4．辛酸-50 %SAS35 %SAS提純雞IgG

  由圖2可以看出，經辛酸-SAS提純的雞IgG再過DEAE纖維素(DE52)離子交換層析柱后的雞gG相對較純。經Sephadex-200分子篩層析未能提高將經離子交換層析提純所得雞IgG的純度。經離子交換層析提純的雞IgG再經20 %SAS鹽析仍不能產生任何良好的效果。通過與美國進口(Sigma公司產品)的經分級沉淀及離子交換層析提純的雞IgG的SDsPAGE結果比較顯示，本試驗提純的雞IgG的純度不次于進口產品。

（圖2）

注：1．辛酸SAS離子交換層析提純雞IgG;

2.辛酸SAS離子交換層析-20 %SAS提純雞IgG

3.辛酸-SAS離子交換層析-Sephadex- G200提純雞IgG;

4.美國Sigma公司雞IgG;

5.SAS分級沉淀-離子交換層析提純兔gG;

6.蛋白質分子量標準;

7.SAS分級沉淀-離子交換層析提純兔gG

2.2  IgG

離子交換層析提純所得兔IgG的純度明顯好于辛酸SAS沉淀法提純得到的兔IgG,這與提純雞IgG時的情況相同。

2.3  IgG HRP

2.3.1   不同HRP/IgG克分子比值對酶標抗體質量的影響將用雞IgG全分子免疫制得的兔抗雞IgG經離子交換層析提純后﹐制備兔抗雞IgGHRP酶標抗體。通過調整不同HRP/ IgG克分子比值獲得5組酶標抗體﹐它們的HRP/IgG克分子比值分別為4.15,3.24,2.49,1.99和2.43。不同HRP/IgG克分子比值酶標抗體的顯色情況見圖3。

（圖3）

注：1)酶標抗體HRPIIgG克分子比值A為4.15,B為3.24,C為2.49,D為1.99，E為2.43.

2)酶標抗體的稀釋度A,一E為1400;A一E為1800

  可以看出，HRP/ IgG克分子比值不同對顯色效果的影響并不呈必然的規律性變化。有的酶標抗體HRP/IgG克分子比值很大，顯色效果卻很好。

2.3.2 標記過程中HRP與NaIO。作用時間對酶標抗體質量的影響由表1可以看出，HRP與 NaIO:作用時間為20 min和16 min時,所標記出的酶標抗體的顯色效果明顯好于作用30min的效果。

2.3.3 辛酸SAS沉淀法和離子交換層析法提純的兔抗雞IgG經同一過程酶標后的比較根據表2可以看出,經辛酸SAS沉淀提純的兔抗雞IgG雖然在純度上較經離子交換層析提純的兔抗雞IgG為差,但是由二者制備酶標抗體的質量卻無明顯差別。

2.3.4  雞IgG重鏈免疫和雞IgG全分子免疫產生并制備的兔抗雞IgGHRP酶標抗體的顯色效果比較從表3結果可以看出，用雞gG重鏈免疫產生的兔抗雞IgG制得的酶標抗體的顯色效果，明顯差于用雞IgG全分子免疫產生的兔抗雞IgG制得的酶標抗體。

2.3.5 用雞IgG重鏈免疫與雞IgG全分子免疫產生并制備的兔抗雞IgGHRP酶標抗體在 Dot-ELISA間接法檢測Yucaipa雞胚尿囊毒中的應用效果比較測試結果表明,雞IgG重鏈免疫與雞lgG全分子免疫產生并制備的兔抗雞IgGHRP酶標抗體,在檢測Yucaipa尿囊液毒時的非特異性斑點產生情況基本一致,從而說明雞IgG重鏈免疫產生并制備的兔抗雞IgGHRP酶標抗體并不能解決檢測Yucaipa雞壓尿囊液毒時存在的非特異性反應問題。

  離子交換層析結合起來,從人血清中提取IgG。其中DEAE纖維素(DE52)吸附去除雜蛋白的條件是pH 5.7，這與其他文獻14 7~”所介紹的離子交換洗脫IgG的pH值條件(6.7～7.4)相差較大。因此在提純雞gG的過程中本試驗只是參考了文獻中的辛酸用量,其他步驟主要按文獻進行。SDSPAGE檢測發現辛酸50 %SAS提純雞IgG的純度離免疫要求還相差很遠,這與文獻中的報道不同。后者用該法從小鼠腹水中提得的單抗IgG的純度在SDSPAGE照片中顯示很好,二者差別是否由提純原料不同造成值得進一步探討。

  我們的研究表明,經辛酸SAS提純的雞IgG(或兔抗雞lgG再經DEAE纖維索(DE52)離子交換層析提純后純度相對較高，可以滿足一些基本實驗需要,如作為實驗參照品、制備酶(或熒光)標記抗體等。

  本試驗按文獻所介紹的HRP與 NaIO。的作用時間(30 min)處理時效果欠佳。作用30 min的兔抗雞IgG HRP的質量遠遠不及作用20 min與作用16 min的質量。此差別也可能由所用試劑的質量或其他方面原因造成，因此希望從事有關方面工作的科研人員注意其時間的選擇和確定。

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