hMSCs人間充質(zhì)干細胞衍生的外泌體可進行無細胞下的骨組織再生

干細胞用于組織再生中存在免疫排斥和畸胎瘤形成等問題，但干細胞衍生的外泌體不會引起這些問題。利用誘導人間充質(zhì)干細胞（hMSCs）成骨分化的外泌體，并用其修飾3D打印的鈦合金支架以實現(xiàn)無細胞的骨再生過程。

骨缺損由多種臨床疾病引起，例如骨感染、骨骼異常、天畸形、骨折、無血管壞死、萎縮性骨不連、骨質(zhì)疏松和骨創(chuàng)傷。骨缺損傳統(tǒng)采用自體移植、同種異體移植。然而，這些療法有其自身的局限性。對于自體移植，受限于供體來源且與缺損部位匹配情況。而對于同種異體移植和異種移植，具有疾病傳播和免疫排斥的風險。

干細胞的植入，例如人間充質(zhì)干細胞（hMSCs）和人脂肪干細胞，被視為替代策略。然而，干細胞的植入面臨重大挑戰(zhàn)，包括免疫排斥、畸胎瘤形成和無方向的細胞分化。在干細胞上植入3D支架可能會引起免疫排斥，引起畸胎瘤形成，并導致無方向的細胞分化。因此，在不使用外部種子干細胞的情況下進行骨再生（稱為無細胞再生）是解決這些源自細胞的問題的有前途的方法。實際上，植入無細胞支架以促進無細胞骨組織再生已成為避免這些問題的一種有前途的策略。

為實現(xiàn)無細胞組織再生，無細胞3D支架應具有可誘導成骨的生化和物理性質(zhì)。可能的生化線索之一是細胞分泌的外泌體，它們是納米顆粒（30-200納米），其脂質(zhì)雙層包裹信號分子，例如miRNA。源于干細胞的外泌體的免疫原性低于細胞本身，因為外泌體含有的膜蛋白（例如主要的組織相容性復合物MHC）較少。

外泌體可以長時間保持其生物學活性。外泌體中的可溶性小分子，例如miRNA、生長因子、細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子，受到脂質(zhì)雙層的保護，并可以釋放到靶組織中。由于外泌體包含一系列遺傳信息，如miRNA一樣，可以指導免疫調(diào)節(jié)和細胞間通訊。外泌體從細胞釋放時，可以通過粘附在受體細胞表面與受體細胞發(fā)生相互作用，并通過脂質(zhì)配體受體相互作用、內(nèi)吞攝入或與細胞膜融合而進行通訊。

由于MSC會將外泌體分泌到培養(yǎng)基中，因此MSC條件培養(yǎng)基將含有外泌體。這可能可以解釋已報道的發(fā)現(xiàn)，即使用MSC條件培養(yǎng)基也可以促進組織再生。例如，以MSC為條件的培養(yǎng)基可以縮小梗死面積以心肌缺血，這種培養(yǎng)基可以增強腎源性上皮細胞的遷移和增殖，并增加腎小管細胞的體內(nèi)存活率。靜脈注射MSC衍生的外泌體可促進神經(jīng)血管重塑。這些發(fā)現(xiàn)表明，包裹在外泌體中的生化物質(zhì)也可能在體外和體內(nèi)誘導成骨。

圖：干細胞衍生的外泌體可進行無細胞下的骨組織再生

因此，在這項研究里，鑒定了hMSCs分泌的成骨外泌體，并使用外泌體修飾3D打印的鈦合金支架（Ti支架）以實現(xiàn)無細胞的骨再生。具體而言，采用了在成骨分化培養(yǎng)基中預分化的hMSC衍生的外泌體，分別在0、4、10、15和20天（稱為EXO-D0、EXO-D4、EXO-D10、EXO-D15和EXO-D20）鑒定可在體外誘導hMSC向成骨細胞分化的外泌體。然后用成骨外泌體填充無細胞的3D打印Ti支架，以實現(xiàn)無細胞的骨再生。Ti支架用于支撐外泌體，因為Ti具有生物相容性，不會引起與組織的免疫反應，并支持骨細胞和礦化的骨基質(zhì)的附著而無任何介入。此外，Ti支架具有理想的性能，例如均勻的結(jié)構(gòu)、高強度、低剛度、高孔隙率、耐腐蝕性和高摩擦系數(shù)。

使用實時PCR、免疫熒光染色、茜素紅染色和堿性磷酸酶（ALP）活性來證實在hMSC衍生的外泌體誘導下hMSC的成骨作用。無細胞的3D Ti支架也被用于在體內(nèi)誘導4和12周的骨組織再生。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外泌體（EXO-D10和EXO-D15）攜帶有誘導分化的miRNA（例如Hsa-miR-146a-5p、Hsa-miR-503-5p、Hsa-miR-483-3p、Hsa-miR- 129‐5p、Hsa‐miR‐32‐5p、Hsa‐miR‐133a‐3p和Hsa‐miR‐204‐5p），因此可以在體外誘導hMSC的成骨分化，并使無細胞的Ti支架能夠通過激活PI3K/Akt和MAPK信號通路在體內(nèi)實現(xiàn)骨組織再生。因此，來自成骨細胞預分化hMSC的外泌體是無細胞骨組織再生的誘導劑。

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