同位素示蹤技術在疾病機制探索中的應用

   細胞凋亡研究

  細胞凋亡是機體通過特定機制調控產生的細胞自發、程序性的死亡，它發生于胚胎發育、免疫防御等階段，具有廣泛的生物學意義。凋亡異?？烧T發多種疾病，如自身免疫性疾病、**癥等。多種**癥的**都是通過誘導**細胞的凋亡途徑（如Caspase-3、Bcl-2/xL、IAPs、MDM2-p53等凋亡通路）實現的。采用同位素示蹤技術對細胞進行實時、無創的觀察有助于研究疾病發生發展的機制。放射性同位素標記的細胞凋亡顯像劑可與凋亡細胞特異性結合，應用于凋亡的早期檢測而不受探測深度制約。在凋亡早期，細胞內會出現膜小葉和細胞內液酸化，采用18F標記2-（5-氟代戊基)-2-甲基丙二酸（ML-10），細胞凋亡時，該探針的丙二酸模體核心中的2個羧基俘獲質子，使負離子分散在環狀結構中，增加疏水性。已被酸化的探針進而通過疏水的羥基到達胞質，結合帶負離子的蛋白質，從而富集于胞質。18F-ML-10已進入臨床研究階段，匹茲堡大學醫療中心Oborski等在已接受**的多形性成膠質細胞瘤患者體內注入18F-ML-10進行檢測，結果顯示體內的**細胞凋亡與該分子探針的攝取量變化相關。用于評估**前和**后早期**細胞凋亡的變化，是臨床上評估新診斷患者的早期**反應的一種新方法。多種凋亡信號通路涉及Caspase-3的活化，靶向Caspase-3是凋亡顯像的重要研究方向。18F-CP18包含與Caspase-3蛋白高度親和的識別序列DEVD（Asp-Glu-Val-Asp），同時還可通過結構中的聚乙二醇鏈進行跨膜轉運。當用細胞凋亡誘導劑處理時，體外細胞實驗測定結果顯示**細胞中Caspase-3依賴性攝取18F-CP18。在凋亡細胞中，活化的Caspase-3剪切PEG鏈使顯像劑滯留在細胞內，從而顯像。將18F-CP18注入非小細胞肺**小鼠模型內，PET顯像后發現術后**部位出現放射性濃影，證明該顯像劑可檢測**癥**中的早期凋亡，有希望開發成新的PET顯像劑。

      除小分子探針外，蛋白多肽活性物質也是同位素標記凋亡探針的重要來源。細胞凋亡早期會出現胞膜內側磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，Ps）的外翻。鈣依賴性磷脂結合蛋白AnnexinV與Ps具有高度親和力（Kd=0.1nmol·L-1）。細胞凋亡時AnnexinV在鈣離子存在下與外翻的Ps結合并變構為三聚體，覆蓋于膜外側的Ps上。99Tcm標記AnnexinV已成為細胞凋亡檢測的常見方法。Witney等使用配體螯合物HYNIC與AnnexinV連接，在Sn2+存在下經99Tcm標記制得99Tcm-HYNIC-AnnexinV。再將該探針注入荷淋巴瘤EL-4的模型小鼠體內，結果顯示**攝取量與**細胞的早期凋亡相關。99Tcm標記的SAAC-PSBP-6多肽與Ps高度親和，研究發現對99Tcm-SAAC-PSBP-6SPECT顯像可以檢測****后**細胞的早期凋亡。

DNA損傷修復研究

DNA損傷是導致基因突變及轉錄活性異常的重要原因。機體通過DNA損傷修復（DNAdamageresponse，DDR）機制以避免細胞對DNA損傷反應異常引發的**疾病。上述過程涉及多信號通路的胞內因子表達變化，這可以為同位素示蹤技術提供理想的位點。由于DDR參與**發生發展過程，利用同位素示蹤技術檢測DDR有助于研究**發生發展機制，并監測DNA損傷**的效果。

      DNA損傷有多種不同的形式，其中包括DNA單鏈斷裂（DNAsingle-strandbreaks，SSBs）和DNA雙鏈斷裂（DNAdouble-strandbreaks，DSBs）。多聚（ADP-核糖）聚合酶-1（PARP-1）在細胞內主要參與DNA損傷修復、維持基因組完整性以及基因轉錄調節等，是DNA單鏈斷裂損傷修復的關鍵位點。PARP-1識別并結合到DNA斷裂處，激活并催化受體蛋白的聚ADP核糖基化，完成DNA修復工作。PARP-1是DNA損傷的主要生物標志物。Zhou等發現苯并咪唑類化合物NU1085的結構類似物可以****PARP-1，其中18F-FluorThanatrace（18F-FTT）具有**的比活力（5.5×106~1.8×107Ci·mol-1），且其IC50也相對較低[（6.3±1.3）nmol·L-1]，MDA-MB-231荷瘤模型（低PARP-1表達）及MDA-MB-468荷瘤模型（高PARP-1表達）等多種移植瘤模型動物注入探針后，PET/CT顯像證明體內**組織對18F-FTT的富集程度與移植瘤模型PARP-1表達呈**相關。18F-FTT探針可以通過監測體內PARP-1水平描述DNA損傷程度。

      DSBs是較嚴重的DNA損傷形式，可能會引發**癥等相關疾病。細胞在發生DSBs時產生應激反應，導致毛細血管共濟失調突變基因產生信號級聯反應。組蛋白H2AX是該級聯反應的重要位點，可被共濟失調突變基因磷酸化形成γH2AX。γH2AX再招募其他修復因子進行損傷修復，是DSBs的重要生物標志物，可作為檢測**細胞DNA損傷修復的靶點。由于γH2AX抗體的相對分子質量較大，難以直接通過胞膜結構，通常需要用細胞穿膜肽（cellpenetratingpeptides，CPPs）TAT進行修飾。Cornelissen等次采用111In修飾anti-γH2AXTAT，并將該探針注入MDA-MB-468****移植瘤模型小鼠。SPECT結果顯示，**對111In-anti-γH2AX-TAT的吸收值與DNA損傷程度**相關。這表明該核素探針可以無創性地觀察**DNA損傷過程。MDA-MB-468****移植瘤小鼠的**組織在輻射（10Gy）下對89Zr-anti-γH2AX-TAT的吸收較對照組（0Gy）明顯更多。2同位素示蹤技術在藥學研究中的應用2.1****靶點研究基于細胞或動物模型的靶向候選**的發現和篩選中，只有找到合適的靶點分子才能更好理解疾病發生發展的分子機制，研究**與靶點結構互相作用的本質，從而更加有針對性地設計和改造化合物，增加**研發的可預測性和成功率。目前已知的**靶點98%以上屬于蛋白質，包括G蛋白偶聯受體、酪氨酸蛋白激酶及磷酸二酯酶等。目前，盡管以RNA干擾（RNAinterference，RNAi）為代表的遺傳學手段在**靶點的鑒定方面有成功的案例，但通過蛋白質芯片、同位素標記的策略以及化學蛋白質組學等技術發現及鑒定**靶點才是更加直接**的方法。其中，同位素示蹤技術作為工具應用于靶點的發現是當前**研究的重要手段。ⅠA和ⅠB期的非小細胞肺**患者接受**后5年存活率分別為83%和71%，而Ⅱ期患者的存活率僅有50%，這說明中期肺**的**模式仍有較大提升空間。目前，手術**和輔助化療仍然是**早期肺**患者的常用方法，在晚期肺****中效果**的免疫檢查點**劑（如PD-1及PD-L1抗體）并未被用來**早期肺**患者，其主要原因是早期肺**組織的**微環境免疫狀況尚不清楚。Lavin等收集了28名早期及晚期肺腺**患者的**樣本、正常肺組織及血液，并在細胞水平上分析樣品，繪制**細胞免疫組分圖譜。研究人員設計出一種“條形碼系統”，其可以對樣本中的所有細胞類型采用不同同位素標記示蹤。然后運用飛行時間質譜流式細胞術（masscytometrybytimeof-flight，CyTOF）與單細胞轉錄組學（single-celltranscriptomics）和肺部**的多重成像技術相結合，在單細胞水平對**細胞的免疫狀況進行同時分析。

     結果顯示在早期肺腺**組織周圍就聚集著大量**性巨噬細胞和T細胞，同時表現出NF-κB誘導激酶（NF-κB-inducingkinase，NIK）細胞的損耗，這表明免疫細胞在**形成早期就產生功能失調。同時，還發現免疫檢查點蛋白PD-1和PD-L1也已經分別出現在部分CD4+和CD8+的T淋巴細胞和巨噬細胞表面，因此，在**疾病早期使用免疫療法有望為臨床**帶來新的希望。

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